运动锻炼对更年期抑郁模型大鼠行为学影响及机制研究*

吕丽华，陈登榜，曾 俊△，代吕霞△

1.武汉市精神卫生中心(武汉 430030)；2.成都医学院(成都 610083)

抑郁症是一种全球性的慢性神经精神障碍。据世界卫生组织统计，目前全世界约有3.5亿人患抑郁症，已成为发病率居全球第二位的疾病[1]。流行病学调查[2]显示，女性抑郁症的发病率大概是男性的2.5倍，尤其在45～55岁的更年期，有近46%女性罹患更年期抑郁症。处于更年期的妇女，由于雌激素急剧减少，身体和精神出现障碍，情绪变化较大，常出现一些过激行为，给患者自身和家庭均带来一定程度痛苦。

运动锻炼是一种能坚持、简单、有效的缓解机体压力的方式。研究[3-4]显示，运动锻炼可增强体质、改善情绪，对身心有积极的效果。脑源性神经营养因子(brain derived neurothrophic factor，BDNF)是神经营养因子家族的成员，与抑郁发生密切相关。本研究探讨运动锻炼能否改善更年期抑郁模型大鼠的抑郁情绪，以及运动锻炼对更年期抑郁模型大鼠血清和海马中BDNF表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性，SD大鼠40只，体重200～240 g，购于成都达硕实验动物有限公司。

1.2 主要实验试剂

BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；BDNF大鼠多克隆抗体(上海碧云天生物技术有限公司)；羊抗鼠IgG抗体(北京中杉生物技术有限公司)；预染蛋白标准品(美国New England公司)；ECL化学发光试剂(德国Millipore公司)；Rat BDNF ELISA Kit分析试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物饲养 自由供水、供食，自然光照。

1.3.2 实验分组 将大鼠随机分成正常组、假手术组、去卵巢组、去卵巢+运动组4组，每组10只。

1.3.3 动物模型 1)卵巢摘除。通过双侧去卵巢手术构建更年期大鼠动物模型，以此模拟女性雌激素缺乏的更年期。大鼠在动物房适应1周后，术前禁食12 h，7%水合氯醛(0.5 mL/100 g)腹腔麻醉，麻醉起效后，俯卧位固定，备皮，背部肋弓下1 cm与脊柱侧面1 cm相交处，开约2 cm切口，钝性分离，暴露腹腔，找到粉红色菜花状的卵巢。在近子宫角位置进行结扎，切除卵巢，常规缝合，同样方法摘除另一卵巢，待大鼠完全清醒后放回笼子。术后连续5 d，腹腔注射青霉素(20万单位/只)预防感染。假手术组手术操作与卵巢摘除手术相同，但不切除卵巢，仅切除双侧卵巢周围同等体积的脂肪。2)慢性不可预知温和应激(CUMS)造模。术后2周，进行慢性不可预见应激以建构更年期抑郁大鼠模型。正常组和假手术组正常饲养，将摘除卵巢的大鼠进行造模，每天随机给予1～2种不同刺激，持续28 d。造模过程中，同种刺激再次出现的间隔周期>5 d。刺激方法：鼠笼倾斜(将鼠笼倾斜至45°)；持续光照(通宵照明12 h)；禁食24 h；禁水24 h；气味刺激(鼠笼内放置2个樟脑球)；旋转刺激(置于旋转架上旋转3 min)；4 ℃冷水中5 min；45 ℃热水中5 min；束缚(橡皮膏束缚四肢限制活动3 h)；无垫料24 h；潮湿垫料24 h；夹大鼠尾巴根部1 min。3)强迫游泳实验。大鼠单独放入透明玻璃圆缸中(高45 cm，直径20 cm, 水深以大鼠尾巴刚好探不到底)，水温(25±1)℃。第1天置于缸内5 min，不记录时间。第2天5 min, 记录大鼠保持漂浮不动的时间。强迫游泳实验在建模结束后和运动锻炼6周后各进行1次。建模成功的模型大鼠随机分为去卵巢组和去卵巢+运动组。

1.3.4 运动锻炼 去卵巢+运动组大鼠开始为期6周的水平跑台锻炼。运动时间45 min，第1周初始速度为10 m/min，每隔5 min速度增加3 m/min，当速度达到20 m/min后，保持20 m/min直至运动结束。第2周初始速度为15 m/min，每隔5 min速度增加3 m/min，当速度达到20 m/min后，保持20 m/min直至运动结束。第3周至第6周保持20 m/min的速度进行运动[5-6]。每周跑步5 d，周六、周日休息。其余组大鼠未给予跑步干预。

1.3.5 样品制备 1)收集血清。大鼠麻醉后，固定，负压抗凝管采集大鼠动脉血。样品室温静置30 min，2 000 r/min，离心半径14 cm，离心20 min，收集上清，-80 ℃保存备用。2)提取海马。立即将各组大鼠断头处死，取出大脑，冰上放置1个培养皿，在培养皿中迅速将海马组织剥离出来，-80 ℃保存备用。3)提取蛋白。脑组织解冻后，加入裂解缓冲液，低温高速匀浆机匀浆，运行3 min，暂停3 min，重复3次。4 ℃，12 000 r/min，离心半径14 cm，离心20 min，提取上清，即为组织的蛋白样本，-80 ℃保存备用。 4)蛋白定量。参照上海碧云天生物技术有限公司BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作。用ROH2O将待测样品进行稀释，将准备好的标准品和样品加入96孔板，再加入BCA工作液，充分混匀，37 ℃放置30 min。酶标仪测定各孔OD562。Excel软件制作蛋白浓度/D值的标准曲线，导出回归方程式。根据公式，乘以稀释倍数，计算出样品蛋白的实际浓度。

1.3.6 ELISA法 参照碧云天生物技术有限公司Rat BDNF ELISA Kit分析试剂盒使用说明书步骤，检测大鼠血清BDNF含量，每个孔均作3个复孔以减少误差。

1.3.7 蛋白质印迹技术 大鼠海马BDNF的表达取蛋白样品，加入5×SDS上样缓冲液混匀；100 ℃加热5 min；10 000 转/min，离心半径14 cm，离心2 min，取上清。电泳条件：5%浓缩胶区域80 V恒压，10%分离胶区域100 V恒压，电泳时间约为120 min。待电泳结束后，取下SDS-PAGE凝胶，剪裁跟凝胶同样大小的PVDF膜(甲醇中浸泡10 s)；凝胶和PVDF膜放入转膜缓冲液中浸泡30 min；按转移电极板负极至正极方向整齐叠放3层滤纸、凝胶、PVDF膜和3层滤纸，4 ℃、200 mA恒流转膜60 min。转膜结束后，取出PVDF膜，4 ℃封闭过夜；1×PBST洗膜10 min×3次；加入按1∶1 000用封闭液稀释的一抗(BDNF抗体)，4 ℃孵育过夜；1×PBST洗膜10 min×3次；加入按1∶2 000用封闭液稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)，37 ℃摇床孵育60 min；1×PBST洗膜10 min×3次；按Millipore ECL化学发光检测试剂盒说明书的操作步骤对膜进行显色，观察结果并拍照存档。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 行为学变化

建模结束后，通过强迫游泳实验，收集大鼠漂浮不动的时间，以明确建模是否成功。结果显示，模型组、正常组、假手术组大鼠的不动时间分别为(153.9±1.1)、(110.2±1.8)、(113.0±1.6)s。与正常组相比，假手术组大鼠的不动时间无明显增加，差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比，模型组大鼠的不动时间明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。强迫游泳实验结果提示更年期抑郁大鼠模型建模成功(表1)。

表1 建模结束后强迫游泳实验总评分结果

运动锻炼6周后，再次进行强迫游泳实验，结果显示，去卵巢+运动组、去卵巢组、正常组及假手术组大鼠的不动时间分别为(124.8±1.3)、(155.8±1.8)、(118.4±1.5)、(121.6±2.0) s。与正常组相比，去卵巢组大鼠的不动时间明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与去卵巢组相比，去卵巢+运动组大鼠的不动时间明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；强迫游泳实验结果提示，中等强度的运动锻炼能有效改善更年期抑郁大鼠的情绪状态(表2)。

表2 运动锻炼6周后强迫游泳试验总评分结果

2.2 大鼠血清BDNF含量

运动锻炼6周后，ELISA检测外周血中BDNF含量结果显示，去卵巢+运动组、去卵巢组、正常组、假手术组BDNF含量分别为(196.5±6.5)、(132.1±2.4)、(216.7±7.6)、(199.5±6.6) μg/L。与正常组相比，去卵巢组BDNF含量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与去卵巢组相比，去卵巢+运动组BDNF含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果证实中等强度的运动锻炼能明显增加更年期抑郁大鼠外周血BDNF的含量(表3)。

表3 运动锻炼6周后血清BDNF含量

2.3 大鼠海马BDNF的表达量

运动锻炼6周后，蛋白质印迹技术进一步检测各组大鼠海马BDNF的表达量，并使用Image Lab软件分析条带灰度值，本研究将目标蛋白与内参条带灰度值的比值作为目标蛋白相对表达量。结果显示，去卵巢+运动组、去卵巢组、正常组、假手术组BDNF相对表达量为(0.520±0.010)、(0.358±0.011)、(0.616±0.015)、(0.588±0.006)。与正常组相比，去卵巢组BDNF相对表达量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与去卵巢组相比，去卵巢+运动组BDNF相对表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白质印迹技术结果证明，中等强度的运动锻炼能明显增加更年期抑郁大鼠海马BDNF的表达(图1、表4)。

图1 蛋白质印迹技术检测海马BDNF的表达

表4 运动锻炼6周后海马BDNF相对的表达量

3 讨论

随着社会的进步，人们工作、生活压力剧增，我国女性抑郁症的发生率也不断增加，其中更年期女性尤为突出。更年期由于激素水平变化，女性易出现心血管、内分泌等身体机能的疾患，还可出现抑郁焦虑等心理问题，严重影响女性的健康与生活。高兵等[7]调查了110名围绝经期妇女，结果显示，出现抑郁症状的妇女约35.5%，其中具有轻度抑郁症状的妇女约76.9%；抑郁症状与更年期综合征症状具有明显的相关性。黄银娟[8]调査发现，家庭、生活环境、社交关系、自我调节能力及运动、既往疾病史等因素对更年期抑郁焦虑状况的发生均有影响作用。本研究通过卵巢切除和慢性不可预知性应激两步法来建造更年期抑郁大鼠模型，利用强迫游泳实验筛选具有明显抑郁症表现的大鼠，以避免去卵巢组和去卵巢+运动组里出现轻度抑郁或正常大鼠，使实验结果更具有可信度[9]。实验结果显示，与正常组相比，模型组大鼠的不动时间明显增加，这与既往研究[9]具有一致性。

药物和电休克等是目前临床常用的抑郁症治疗方式，但由于不良反应大，导致患者依从性差，促使研究者们努力寻找更有效的治疗方式。研究[10]认为，运动锻炼作为一种简单有效、不良反应极少的治疗方式，可有效缓解抑郁症患者的症状，改善患者的情绪状态。Dunn等[11]认为，在抑郁症的治疗中，运动锻炼的类型、持续时间及运动频率等因素会产生不同的效果。长时间、高强度的运动锻炼由于过度激活HPA轴而使患者身心紧张，导致抑郁症状加重[12]；而中等强度的运动锻炼则是减少应激的最有效方法[13]。因此本实验采用中等强度的运动，运动锻炼的参数在相关文献基础上进行了细微的调整[14]，实验结果证实中等强度的运动锻炼的确可以明显改善更年期抑郁模型大鼠的情绪症状。

BDNF在神经细胞的生长发育和神经元的修复方面具有十分重要的作用，BDNF在海马、杏仁核及额叶皮层等部位表达量较高。研究[15]发现，BDNF与抑郁症的发生密切相关，应激可引起脑边缘系统(如海马、前额叶皮质)BDNF蛋白表达明显下降，以及相关的边缘系统结构萎缩。研究[16]发现，抑郁症患者外周单核细胞BDNF mRNA的含量明显低于正常人，且BDNF mRNA含量的下降幅度与抑郁的程度呈正比。因此外周血和中枢BDNF含量若发生一致改变，能较好揭示BDNF在抑郁症发病中的作用。结合更年期抑郁大鼠模型，本实验探讨了外周血BDNF含量和海马BDNF表达与更年期抑郁症的关系，结果表明，更年期抑郁模型大鼠外周血BDNF含量和海马BDNF的表达是同步下降；经过6周运动锻炼后，去卵巢+运动组外周血BDNF含量和海马BDNF的表达量较去卵巢组明显升高。但本研究也发现，虽然6周运动锻炼能明显增加更年期抑郁模型大鼠外周血BDNF含量及中枢BDNF的表达，有效改善大鼠的抑郁状态，但并未使大鼠完全恢复正常状态，分析其原因可能是运动锻炼的持续周期还未找到最理想的值，在下一步实验中，我们将继续探究运动锻炼8、12周及更长的时间对更年期抑郁模型大鼠行为学及机制的影响。

综上所述，本研究结果显示，更年期抑郁模型大鼠经过6周中等强度的运动锻炼后，情绪状态得到明显有效的改善；外周血BDNF含量和海马BDNF表达量升高，为更年期抑郁治疗提供了新的思路。