不同氮效率紫花苜蓿叶特征及其产量效应研究

王 静， 刘晓静， 程甜甜， 童长春， 汪 雪

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃 兰州 730070)

植物的叶是植物生产过程中进行光能转换的场所和光合产物的重要载体。研究表明，植物95%以上的干物质来源于叶的光合作用，叶特性直接影响着光合产物的积累，进而影响其产量和品质[1]。近年来，关于植物叶特征与生产特性关系的研究也在不断深入，在对水稻(Oryzasativa)和小黑麦(Triticalewittmack)的研究中发现叶面积对作物产量和品质有显著影响[2-3]，叶面积的增大，扩展了作物的光合场所，从而提高其光合能力，积累较多的有机物。研究还表明，叶片数[4]、叶茎比[5]、叶重[6]、比叶重[7]等叶片外部特征与作物生产性能密切相关，叶片内部输导组织维管束数目和大小也对产量起决定作用[8]。在牧草生产中光能利用的诸多因子中叶面积对产量的贡献最大，这是因为叶面积不仅是指征群体冠层结构的重要指标之一，更是以收获营养体为目标的牧草作物产量的重要构成因子，可直接影响牧草的产量及品质，因而其对产量的贡献较大[9]。氮效率指的是植物对氮素的固定、吸收和转化能力的综合体现[10]。研究认为，作物氮效率因其品种的形态特征及生理特性不同而异，植物氮高效主要表现在：叶片光合效率高[11],根系吸氮能力强[12-13],氮素积累与干物质生产较一致，地上和地下部生长协调[14-15],氮同化酶基因高效表达[16-17]等方面，可见，叶特性对植物氮效率至关重要。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作为世界上栽培最早、分布最广的多年生豆科牧草，由于其具有独特的氮素利用方式，与禾谷类作物相比可以大大提高粗蛋白质的产出，所以紫花苜蓿成为了畜牧业生产中不可或缺的优质植物性蛋白饲料。在以收获营养体为目标的牧草生产中，叶是其产量构成的重要因素，因此，紫花苜蓿叶特性越突出，其产量就越高，品质也越好，因而氮积累量也越高，蛋白生产量就越大[18-19]。在存在氮效率差异的紫花苜蓿品种间，因其氮素吸收利用能力的差异，紫花苜蓿对氮肥的响应不同，氮肥报酬率差异极显著[20]，干物质积累与氮积累均存在差异[21]。为此，本研究以紫花苜蓿氮效率差异品种为研究对象，通过对不同氮效率紫花苜蓿叶形态和营养特征及其输导组织的解剖结构展开探讨，以期明确不同氮效率紫花苜蓿叶特征差异及其产量和品质效应，为进一步深入开展紫花苜蓿氮效率差异机制研究提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取4个不同氮效率紫花苜蓿品种(紫花苜蓿品种是由本团队前期研究筛选所得的4种不同氮效率类型)：‘LW6010’(氮高效型)，‘甘农3号’(氮常效型)，‘甘农7号’(氮反效型)和‘陇东苜蓿’(氮低效型)。紫花苜蓿品种均由甘肃农业大学草业学院提供；供试肥料为：氮肥使用兰州化学工业公司生产的尿素CO (NH2)2(N≥46%)；磷肥使用金昌奔马复合肥有限责任公司生产的Ca (H2PO4)2(P2O5≥12%)。

1.2 试验设计

1.2.1试验地概况 试验地位于甘肃农业大学，地理位置为北纬36°03′，东经103°40′，海拔高度为1 525 m，属中温带大陆性气候，日照多，气候干燥，昼夜温差大，年均温10.3℃，年平均降水量为360 mm，主要集中在7，8，9三个月内，年均蒸发量1 410 mm，年日照数平均2 600 h，无霜期180 d以上。试验地土壤概况如表1所示。

表1 土壤理化性状

1.2.2试验设计 本试验采用二因素(紫花苜蓿品种、施氮量)裂区试验设计，紫花苜蓿品种是4种不同氮效率类型，施氮量为0和103.5kg·hm-2(纯氮)两个氮水平，分别记为N0和N103.5，共8个处理，每个处理3次重复，共24个小区，每个小区面积为12 m2(3 m×4 m)，每个小区之间以50 cm小田埂分开，种植总面积为288 m2。磷肥作为底肥一次性施入，施用量为900 kg·hm-2，氮肥的施用量为225 kg·hm-2，分别于播种前、返青期和每次刈割后施入，施肥后充分灌溉。本试验于秋天进行播种(8月18日)，播种前种子经根瘤菌液浸种，播种量为15 kg·hm-2，播种深度为2～4 cm，人工条播，行距20 cm。初花期刈割进行指标的测定，于种植第2年进行刈割(5月15日、6月26日、8月11日、10月5日)，共刈割4茬。除施肥不同外，其余田间管理均相同。

1.3 测定指标及方法

每小区分别选取30株代表性的植株并从每株中随机选取一单枝，茎叶分离，分别测其鲜重、叶片数、叶面积，之后放入105℃的烘箱中杀青15 min，在85℃下烘干至恒重，测其叶干重、叶茎比等。其中叶面积用叶面积仪(CI-202型，美国CID公司)测量。根据以上数据计算出比叶重、叶茎比，计算公式如下：比叶重(g·cm-2)=叶干重/叶面积；叶茎比=叶干重/茎干重。

输导组织解剖结构：紫花苜蓿返青后15 d(苗期)取同一部位的叶片为材料，立即放入福尔马林-乙酸-乙醇(Formalin-aceto-alcohol，FAA)混合溶液中固定24 h备用。以石蜡切片技术为基础[22]，采用LEICA全自动切片机(德国)代替传统方法制作高精度切片，使用Carl Zeiss型万能显微摄像光学显微镜(德国)实现同期拍照、并利用Axio-Vision型图像分析系统(德国)采集数据。每处理选取3个样本，每个样本随机取10个视野。

产量(kg·hm-2)：刈割后测定各小区鲜草产量。同时，分别取样500 g自然风干至恒重，计算鲜干比，折算干草产量。用茎叶比和干草产量折算出叶产量，可计算出叶增量，计算公式如下：叶增量(g·m-2·d-1)=叶产量/天数。

蛋白含量：采用H2SO4-H2O2法消煮后，用凯氏定氮法测定[23]。蛋白积累总量(kg·hm-2)=刈割干草产量(kg·hm-2)×蛋白含量(%)[22]。

酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)和中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)：采用Van Soest法测定[20]。

1.4 数据统计与分析

本研究采用Excel 2010和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。采用单因素(One-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(α=0.05)，用Pearson法对产量和叶特性各指标进行相关分析。通过标准化回归系数的方法[9]计算通径系数，并将相关系数分解为直接通径系数与间接通径系数的代数和，可直观反映叶特征各因子对产量的效应。用Excel 2010软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同氮效率紫花苜蓿叶的特征

2.1.1叶重、叶面积 由表2可知，4个紫花苜蓿品种中，不施氮和施氮处理时‘LW6010’的叶重在第2茬和第4茬显著高于‘陇东苜蓿’，叶面积在各茬均显著高于‘陇东苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘甘农3号’的叶重在各茬均显著提高，‘LW6010’和‘甘农3号’的叶面积除第1茬外均显著提高(P<0.05)。

2.1.2比叶重、叶片数 本研究中，在不施氮和施氮处理下，‘LW6010’的比叶重和叶片数在各茬均显著高于‘陇东苜蓿’(P<0.05)；施氮后，‘甘农3号’的比叶重除第2茬外均显著提升，叶片数在各茬均显著提升(P<0.05)(表3)。

表3 不同氮效率紫花苜蓿比叶重和叶片数

2.1.3叶增量、叶茎比 4个紫花苜蓿品种在不同氮水平下，‘LW6010’的叶增量在第1茬和第4茬显著高于‘陇东苜蓿’，叶茎比除第4茬外均显著高于‘陇东苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘甘农3号’的叶增量除第3茬外均显著提高，叶茎比在各茬均显著提高(P<0.05)(表4)。

表4 不同氮效率紫花苜蓿叶增量和叶茎比

2.1.4叶输导组织解剖结构 与‘陇东苜蓿’(图1-D,H)相比，在相同氮水平下‘LW6010’(图1-A,E)维管束面积大，木质部区域宽广，导管数目多，主脉凸起明显，且维管束、韧皮部、木质部面积和导管数量均显著高于‘陇东苜蓿’(P<0.05)(表5)。此外，与不施氮相比，在供氮103.5 kg·hm-2时，‘LW6010’(图1-E，表5)的维管束、韧皮部、木质部面积和导管数量，增幅分别为28%，21%，27%和33%，而‘陇东苜蓿’(图1-H，表5)各增幅分别为20%，17%，18%和15%(表5)。

表5 不同氮效率紫花苜蓿叶输导组织解剖结构

图1 不同氮效率紫花苜蓿叶输导组织解剖结构

2.1.5叶营养特性 4个紫花苜蓿品种中，不施氮和施氮均表现为‘LW6010’的叶蛋白含量显著高于‘陇东苜蓿’，叶蛋白积累总量除第1茬外均显著高于‘陇东苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘LW6010’和‘甘农3号’的叶蛋白积累总量除第2茬外均有显著提高(P<0.05)(表6)。

表6 不同氮效率紫花苜蓿叶蛋白含量和叶蛋白积累总量

2.2 不同氮效率紫花苜蓿的生产性能

2.2.1产量 由表7可知，4个紫花苜蓿品种中，在不施氮和施氮时均表现为：‘LW6010’的总产量显著高于‘陇东苜蓿’(P<0.05)。随着氮肥的施入，‘LW6010’、‘甘农3号’和‘甘农7号’的总产量均显著上升(P<0.05)。

表7 不同氮效率紫花苜蓿的产量

2.2.2粗蛋白含量 本研究中，4个紫花苜蓿品种在不施氮和施氮均表现为：‘LW6010’的粗蛋白含量在第4茬显著高于‘陇东苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘LW6010’的粗蛋白含量除第4茬外均显著升高，‘甘农3号’、‘甘农7号’和‘陇东苜蓿’的粗蛋白含量在各茬均显著升高(P<0.05) (表8)。

表8 不同氮效率紫花苜蓿粗蛋白含量

2.2.3酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维 4个紫花苜蓿品种中，不施氮和施氮时‘LW6010’的ADF在第3茬和第4茬显著低于‘陇东苜蓿’，NDF除第4茬外均显著低于‘陇东苜蓿’(P<0.05)。施氮后，‘LW6010’、‘甘农3号’和‘陇东苜蓿’的NDF显著下降(P<0.05)。

2.3 紫花苜蓿叶特征因子的产量效应

由表9可知，‘LW6010’、‘甘农3号’、‘甘农7号’和‘陇东苜蓿’叶特征各因子对产量直接效应分别依次为：叶面积(0.264)>叶重(0.241)>叶片数(0.220)>叶增量(0.216)>比叶重(0.169)>叶茎比(0.026)；叶重(0.339)>叶面积(0.311)>叶片数(0.229)>比叶重(0.170)>叶茎比(0.062)>叶增量(0.028)；叶重(0.428)>叶面积(0.355)>叶片数(0.117)>比叶重(0.075)>叶增量(0.074)>叶茎比(0.026)；叶重(0.334)>叶面积(0.331)>叶片数(0.158)>叶增量(0.152)>比叶重(0.149)>叶茎比(—0.068)。

表9 不同氮效率紫花苜蓿ADF和NDF

表10 不同氮效率紫花苜蓿叶特征因子对产量的直接及间接效应

3 讨论

3.1 不同氮效率紫花苜蓿叶特征差异

以营养体为收获目标的牧草中，叶特征对其生产性能的影响非常重要。在本研究中发现，无论氮水平高低，紫花苜蓿的叶特征在4个不同氮效率品种间均存在差异。其中，氮高效紫花苜蓿品种‘LW6010’的叶特征综合表现最好，‘陇东苜蓿’叶特征综合表现最差，前人通过对烟草(Nicotianatabacum)、小麦(Triticumaestivum)、水稻等的研究也发现叶茎比、叶面积、比叶重等叶特征在不同氮效率类型间存在差异[24-26]。除叶片生长特性外，叶特征的差异还体现在内部结构上，比如输导组织。植物的输导组织是用来运输水分和养分的，韧皮部和木质部作为植物三大输导组织之一，通常负责将植物光合作用所产生的有机物输送到生长旺盛的组织和器官中[27]，因此维管束的生长发育情况和导管数量必然会影响植物对养分的吸收和利用。本研究中，‘LW6010’的维管束面积、韧皮部面积、木质部面积最大，导管数量最多，且显著高于‘陇东苜蓿’，因此‘LW6010’叶片生长较好。同时‘LW6010’输导组织发育较佳，具有较高的氮营养吸收、运输及转化能力，这也是‘LW6010’具有氮营养高效特征的原因之一。此外，蛋白含量是决定饲料品质的重要指标，紫花苜蓿收获的主要是茎叶等营养体，其叶片的营养特性在很大程度上决定着牧草的产量和品质。本研究中，‘LW6010’叶蛋白含量和叶蛋白积累总量高于其他品种，叶营养品质更好，氮营养效率更高。氮积累主要是以蛋白总量的形式体现，因此，营养品质与氮素吸收利用效率密切相关。崔文芳等[28]通过对不同氮效率高产玉米(Zeamays)的研究发现在同一氮素水平下，高效型杂交种吐丝期穗三叶含氮量均高于低效型，王小纯等[29]和姜瑛等[30]在小麦的研究中均表明氮肥利用率高的小麦品种其叶片氮含量高于氮肥利用率低的品种。总之，氮高效紫花苜蓿品种‘LW6010’叶特征表现优于‘陇东苜蓿’，而‘甘农3号’和‘甘农7号’则介于二者之间。由此可见，不同氮效率紫花苜蓿的叶特征存在差异，紫花苜蓿叶特性是体现其氮高效的重要特征。

3.2 紫花苜蓿叶特征因子对产量的影响

紫花苜蓿是以收获营养体为目标，因此其叶特征与产量关系非常密切，有研究表明叶片对紫花苜蓿产量的贡献能达到30%～60%[31]。本研究中采用通径分析法得出4个不同氮效率紫花苜蓿品种的叶特征各因子对产量的直接效应表现为叶重和叶面积对产量的贡献最大，这是因为叶重是以收获营养体为目标的饲草重要构成因子，可直接决定紫花苜蓿的产量，因而对其产量的影响最大，已有研究也证实产量与叶重成极显著正相关关系[6]。叶面积因其是评价植物生长状况的重要参数而与产量密切相关，是植物进行估产的重要指标之一，因此足够的叶面积是产量的保证[2,32]，一般叶面积高的品种，产量也相对较高[33]。另外，叶片数也是影响产量的重要因子之一，这是因为适当增加叶片数，能使光合叶面积增大，有利于紫花苜蓿积累较多的有机物，进而增加产量[34]。

4 结论

紫花苜蓿的叶特征在不同氮效率品种间均存在差异，并且紫花苜蓿的叶特性是体现其氮高效的重要特征，无论环境氮水平高低，氮高效紫花苜蓿品种‘LW6010’叶特征综合表现总是优于‘陇东苜蓿’，‘甘农3号’和‘甘农7号’叶特征综合表现则介于前二者之间。

利用通径分析发现，紫花苜蓿叶特征各因子中叶面积和叶重的产量效应最突出。