MAPKAPK5-AS1在肝癌中的临床意义及通过AKT/mTOR通路调控增殖和转移的机制研究*

周 健，韩龙江

1.重庆市荣昌区人民医院肝胆外科，重庆 402460；2.重庆市万盛经开区人民医院消化内科，重庆 400800

一项全球性统计报告显示，2018年有841 080例新发肝癌患者，占所有肿瘤的4.7%，排名第7位；2018年死于肝癌的患者为782 685例，占所有死于肿瘤患者的8.2%，排名第2位[1]。手术切除和化学疗法是治疗原发性肝癌的主要方法，但是由于肝组织中的血管丰富，极易发生复发和转移[2]。研究显示，肝癌的复发率高达80%[3]。寻找新的生物标志物、探索肝癌复发转移的机制具有重要的现实意义。

长链非编码RNA(lncRNA)是一系列不具有编码功能的单链RNA，长度为200 nt至100 000 nt。lncRNA可以通过调节表观遗传、激活或干扰转录的作用调控基因表达[4]。此外，lncRNA可以像“海绵”一样吸收微小RNA(miRNA)并抑制miRNA的功能，从而在转录后水平上调控基因的表达水平[5]。MAPKAPK5-AS1是新发现的一种与肿瘤有关的lncRNA，国内有研究显示，过表达MAPKAPK5-AS1后肺癌细胞的侵袭能力降低而凋亡率升高，说明了MAPKAPK5-AS1在肺癌中的调控作用[6]。也有研究显示MAPKAPK5-AS1可以通过调控p21蛋白的表达水平诱导结肠癌细胞的增殖[7]。一项关于癌症基因组图谱(TCGA)数据库和NCBI(GSE65485)数据库的生物信息学分析构建了肝癌中的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，其中6个关键的lncRNA包括MAPKAPK5-AS1[8]，然而，MAPKAPK5-AS1与肝癌预后的关系及对肝癌细胞的调控作用和机制鲜见报道。本研究旨在探讨MAPKAPK5-AS1在肝癌中的表达特点，并分析MAPKAPK5-AS1与肝癌临床病理参数之间的关系，通过细胞实验分析MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞生物学行为的影响，并初步分析作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源 收集2013年1月至2015年1月的肝癌组织和对应的距离肿瘤边缘3 cm以上的癌旁正常组织标本各90份，其中男70例，女20例；年龄32～77岁，平均(52.64±5.94)岁。纳入标准：(1)经过病理学活检确诊为肝癌；(2)年龄20～80岁；(3)首次确诊，无其他原发性肿瘤，标本收集前未接受化疗、放疗、靶向疗法等治疗；(4)知情同意。排除标准：(1)肿瘤性质、分期等临床病理等无法确定；(2)基本资料缺失。所有标本保存在-80 ℃环境下。通过RT-qPCR检测各组织中MAPKAPK5-AS1的表达水平。本研究符合《赫尔辛基宣言》，并得到医院伦理委员会的批准。

1.2仪器与试剂 人正常肝细胞MIHA和4株肝癌细胞系Huh7、LM3、7721和HepG2(ATCC，美国)；DMEM培养基血清和抗体(Invitrogen公司，美国)；MAPKAPK5-AS1 pcDNA3.1、shMAPKAPK5-AS1及相应的阴性对照(GenePharma公司，中国)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美国)；TRIzol(Sigma公司，美国)；PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara公司，日本)；CCK-8试剂盒(Beyotime研究所，中国)；Transwell小室购自Becton Dickinson公司(美国)；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪和Annexin V-FITC/碘化丙锭(PI)试剂盒(BD Biosciences公司，加拿大)；光学显微镜(奥林巴斯公司，日本)；抗体AKT、mTOR和山羊抗兔IgG H&L二抗(Abcam公司，美国)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)；化学发光显色试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)。

1.3细胞培养、分组和转染 将DMEM培养基中(37 ℃，5%的CO2)处于对数生长期的LM3细胞分为shNC组和shMAPKAPK5-AS1组，HepG2细胞分为vector-NC组和MAPKAPK5-AS1组。shMAPKAPK5-AS1组首先通过转染100 pmol的3种不同的shMAPKAPK5-AS1(分别为sh1、sh2和sh3)沉默MAPKAPK5-AS1；MAPKAPK5-AS1组转染100 pmol的MAPKAPK5-AS1 pcDNA3.1来过表达MAPKAPK5-AS1，利用LipofectamineTM2000进行转染，shNC和vector-NC组分别转染等量的空载质粒作为对照，转染条件为7 ℃，5%CO2，48 h。

1.4生物信息学分析 利用工具网站GEPIA分析TCGA数据库中MAPKAPK5-AS1在肝癌组织中的表达特点及其与TNM分期的关系，通过Kaplan-Meier分析不同MAPKAPK5-AS1表达水平与肝癌患者总生存率和无进展生存期之间的关系。

1.5检测指标和方法

1.5.1RT-qPCR 将肝癌组织或细胞系通过TRIzol获得总RNA，分别通过PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反转录(37 ℃,15 min;85 ℃,5 s)和qPCR(95 ℃ 10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min,40个循环；65 ℃ 45 s)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作内参，通过2-ΔΔCt分析肝癌组织和细胞系中MAPKAPK5-AS1的相对表达水平。MAPKAPK5-AS1上游引物：5′-GGC GTC GTG AGG TAT GGA TGT TC-3′，下游引物5′-GCT TGA CCA CTT CTC GGC TGT G-3′；GAPDH上游引物：5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′，下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG-3′。

1.5.2CCK-8检测增殖 将总体积为100 μL、总数量1×104的细胞接种在96孔板中。培养1、2、3、4、5 d后，添加10 μL的CCK-8，并在37 ℃下培养2 h染色。用酶标仪测量450 nm处的吸光度(A)。

1.5.3流式细胞术检测凋亡 使用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡率。根据说明书，细胞经消化、洗涤后，分别加入5 μL的Annexin V-FITC和PI，并在黑暗中孵育15 min，然后通过流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.5.4划痕愈合试验检测迁移 将接种于6孔板中的1×106个细胞培养至达到约90%的融合，然后使用200 μL的移液器枪头垂直、均匀地做一道划痕，洗去被划掉的细胞并在相同条件下继续培养48 h。通过光学显微镜观察并拍照，计算划痕前缘移动距离百分比=前缘移动距离/划痕宽度×100%。

1.5.5Transwell检测侵袭 将基质胶和完全培养基分别添加到Transwell的上部和下部腔室中。将1×104个细胞添加在上室中并孵育48 h。将入侵进入下室的细胞用20%甲醇固定并用0.1%结晶紫染色，计数进入5个视野中每个视野细胞数的平均值。

1.5.6Western blot检测蛋白 通过细胞裂解液提取细胞或组织中的总蛋白，并通过BCA试剂盒检测浓度。 通过SDS-PAGE(120 V，90 min)分离出30 μg的总蛋白。将分离的蛋白质转移至PVDF膜上(90 V，90 min)，并加入5%的脱脂牛奶孵育1 h进行封闭。然后分别加入1∶500稀释的anti-AKT和anti-mTOR并分别在4 ℃下孵育过夜。 然后将HRP标记的山羊抗兔二抗以1∶5 000稀释并加入到PVDF膜中并在室温下添加2 h。GAPDH作为内参，使用Image J 1.8.0软件分析目标蛋白条带的灰度值计算相对表达水平。

1.6统计学处理 使用GraphPad Prism7.0进行统计分析。通过Kaplan-Meier分析临床肝癌标本中MAPKAPK5-AS1表达水平与预后的关系。采用χ2检验比较MAPKAPK5-AS1高表达和低表达的差异。组间的比较使用单因素方差析和Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1生物信息学分析结果 在TCGA数据库中，MAPKAPK5-AS1在肝癌中的表达水平高于正常肝组织，并且不同TNM分期的肝癌组织中MAPKAPK5-AS1表达水平比较差异有统计学意义(F=7.28，P<0.001)，随着分期的升高，MAPKAPK5-AS1水平也随之升高。并且MAPKAPK5-AS1高表达的肝癌患者的生存率和无进展生存期均明显低于MAPKAPK5-AS1低表达患者(P<0.001，P=0.037)。见图1。

注：A为在TCGA数据库中，MAPKAPK5-AS1在肝癌组织和正常组织中的表达水平比较；B为MAPKAPK5-AS1在TNM分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期肿瘤组织中的表达水平比较；C为通过Kaplan-Meier分析肝癌组织中MAPKAPK5-AS1表达水平与生存率之间的关系；D为通过Kaplan-Meier分析肝癌组织中MAPKAPK5-AS1表达水平与无进展生存期之间的关系。

2.2MAPKAPK5-AS1与肝癌患者的TNM分期、血管侵犯和不良预后有关 为了分析MAPKAPK5-AS1在肝癌中的临床意义，收集了90份肝癌组织和癌旁正常组织标本。RT-qPCR结果显示，MAPKAPK5-AS1在肝癌组织中的相对表达水平(2.47±0.62),明显高于癌旁组织(1.00±0.29)，差异有统计学意义(P<0.05)。根据MAPKAPK5-AS1表达水平将90份标本分为低表达组和高表达组，结果表明，MAPKAPK5-AS1高表达与较高的TNM分期和血管侵犯有关(P<0.05)，见表1。生存分析结果还显示，MAPKAPK5-AS1高表达的肝癌患者的生存率明显低于MAPKAPK5-AS1低表达患者(P<0.05)，见图2。

表1 MAPKAPK5-AS1与肝癌患者的临床病理特征的关系(n)

注：通过Kaplan-Meier分析肝癌组织中MAPKAPK5-AS1表达水平与生存率之间的关系，P=0.009 6。

2.3MAPKAPK5-AS1沉默和过表达肝癌细胞模型的构建 通过RT-qPCR检测人正常肝细胞MIHA和4株肝癌细胞系Huh7、LM3、7721和HepG2中MAPKAPK5-AS1表达水平，发现4株肝癌细胞系中MAPKAPK5-AS1表达水平明显高于人正常肝细胞(P<0.05)。其中LM3中MAPKAPK5-AS1表达水平最高，是MIHA的(4.06±0.58)倍；HepG2中MAPKAPK5-AS1表达水平相对最低，为MIHA的(2.25±0.24)倍。利用LM3细胞构建MAPKAPK5-AS1沉默的细胞模型，转染后细胞中MAPKAPK5-AS1的表达水平降低至shNC组的(0.24±0.04)。利用HepG2细胞构建MAPKAPK5-AS1过表达的细胞模型，转染后细胞中的MAPKAPK5-AS1的表达水平升高至vector-NC组的(2.64±0.31)倍。

2.4沉默MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 为分析MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞的影响，将LM3细胞分为shNC组和shMAPKAPK5-AS1组(转染sh1质粒)，结果显示，shMAPKAPK5-AS1组细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显低于shNC组(P<0.05)，而shMAPKAPK5-AS1组的凋亡率明显高于shNC组(P<0.05)，见图3、表2。

图3 沉默MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞LM3增殖能力的影响

表2 沉默MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞LM3凋亡、迁移和侵袭的影响

2.5过表达MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 为分析MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞的影响，将HepG2细胞分为vector-NC组和MAPKAPK5-AS1组。结果显示，MAPKAPK5-AS1组细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显高于vector-NC组(P<0.05)，而MAPKAPK5-AS1组的凋亡率明显低于vector-NC组(P<0.05)，见图4、表3。

表3 过表达MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞HepG2凋亡、迁移和侵袭的影响

图4 过表达MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞HepG2增殖能力的影响

2.6MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞中AKT/mTOR通路的影响 进一步研究结果显示，shMAPKAPK5-AS1组的AKT和mTOR蛋白水平明显低于shNC组(P<0.05)；MAPKAPK5-AS1组的AKT和mTOR蛋白水平明显高于vector-NC组(P<0.05)，见图5。

注：A为Western blot检测沉默MAPKAPK5-AS1对AKT/mTOR通路中蛋白表达水平的影响；B为Western blot检测过表达MAPKAPK5-AS1对AKT/mTOR通路中蛋白表达水平的影响；与shNC组或与vector-NC组比较，aP<0.05。

3 讨 论

由于肝癌发病隐匿，缺乏早期特异性临床指征，并且体检在我国覆盖范围有限，导致大多数患者在确诊时已经处于晚期或发生了转移，失去了手术根治的机会。复发和转移是导致肝癌患者死亡的重要因素，但是关于肝癌转移的机制仍不明确[9]。分析肝癌发生和进展的分子机制是发现诊断和治疗肝癌新的靶标的重要手段。

lncRNA在肝癌中的作用已经被较多研究进行了验证，如MCM3AP-AS1可以通过靶向miR-194-5p诱导肝癌进展[10]。lncRNA AY可以通过调控ITGAV基因的转录促进肝癌的转移[11]。MAPKAPK5-AS1(Ensembl：ENSG00000234608)位于12号染色体(NC_000012.12)，LUAN等[12]的研究显示，MAPKAPK5-AS1与胶质瘤患者预后有关，并且基因集富集分析结果显示，该基因参与调控自噬。也有体外研究显示，MAPKAPK5-AS1可以通过靶向let-7f-1-3p促进结直肠癌细胞的增殖和转移[13]。在本研究中，笔者首先进行生物信息学分析并发现了在肝癌组织中MAPKAPK5-AS1的表达水平明显上调，并且高MAPKAPK5-AS1表达水平与较高的TNM分期、更低的生存率和低的无进展生存期有关，提示了MAPKAPK5-AS1的促癌作用。为了进一步分析MAPKAPK5-AS1的临床意义，本研究收集了90份肝癌标本和对应癌旁正常组织标本，RT-qPCR结果也显示，MAPKAPK5-AS1在肝癌组织中明显升高。此外，MAPKAPK5-AS1高表达与较高的TNM分期、血管侵犯和更低的生存率有关。这提示MAPKAPK5-AS1与肝癌的发生和发展有关，并且可能成为诊断和预测肝癌的生物标志物。

为进一步分析MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞的影响，本研究首先分析了人正常肝细胞MIHA和4株肝癌细胞系中MAPKAPK5-AS1的水平，与临床研究结果和生物信息学的分析结果一致，MAPKAPK5-AS1在肝癌细胞系中过表达。然后分别利用LM3细胞和HepG2细胞构建MAPKAPK5-AS1沉默和过表达的肝癌细胞模型，结果显示，MAPKAPK5-AS1升高后，细胞的增殖、迁移和侵袭的能力也随之升高，并且凋亡率降低；而沉默MAPKAPK5-AS1对肝癌细胞的影响与之相反。此外，本研究结果还发现，过表达MAPKAPK5-AS1可以使细胞中AKT和mTOR蛋白的水平升高。AKT/mTOR通路是肝癌发生和进展的关键通路之一[14]，并且最近研究显示AKT的表达会受到lncRNA的调控，KOIRALA等[15]的研究结果显示lncRNA AK023948可以通过促进AKT的转录并最终引起AKT蛋白的升高，参与乳腺癌进展。也有研究显示，lncRNA MEG3可以诱导AKT/mTOR 通路的抑制，从而缓解类风湿性关节炎的炎性反应[16]。lncRNA SNHG14可以通过使miR-21海绵化抑制miR-21对AKT的促进作用，从而在转录后水平上诱导AKT的表达[17]。这提示MAPKAPK5-AS1对肝癌的促进作用可能与AKT/mTOR通路有关，MAPKAPK5-AS1可能通过与AKT和mTOR的基因的启动子结合，促进其转录上调其表达水平；MAPKAPK5-AS1也可能通过对应的miRNA在转录后的水平上诱导AKT和mTOR的过表达，从而发挥促进肝癌增殖和转移以及抑制凋亡的作用。

综上所述，本研究发现MAPKAPK5-AS1高表达与肝癌患者较高的TNM分期、血管侵犯和更低的生存率有关，并且MAPKAPK5-AS1可能通过促进AKT/mTOR通路促进肝癌增殖、转移和抑制凋亡。关于MAPKAPK5-AS1在肝癌诊断和预后预测中的作用值得进一步扩大标本分析，MAPKAPK5-AS1对肝癌的促进作用仍需要进一步的体内试验验证，此外，MAPKAPK5-AS1调控AKT/mTOR通路的分子机制也需要深入研究。