外周血单个核细胞NLRP3的表达与脓毒症急性肾损伤发生及进展的相关性分析*

龚光远，张文军△，陈 兰

1.重庆市綦江区人民医院重症医学科，重庆 401420；2.重庆医科大学附属第一医院重症医学科，重庆 400016

目前，随着生物医学研究的不断深入，脓毒症的发病机制已得到初步明确。但脓毒症的病死率仍居高不下，脓毒症作为一类急性炎症性疾病，可通过激活炎性通路，导致重要脏器损伤。有研究显示，肾脏是脓毒症引起损伤的首要脏器，肾损伤发病急且进展快，是导致脓毒症患者死亡的重要原因之一[1]。以往相关研究运用缺血-再灌注损伤来解释脓毒症急性肾损伤的发生机制，但随着近年来相关研究的深入，发现感染后机体炎性反应的激活与放大导致的肾小管细胞损伤及过度凋亡是脓毒症急性肾损伤发生与进展的重要机制[2]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体及下游信号通路的激活是机体炎性反应持续及放大的重要原因之一，该信号通路与炎症性疾病的发生及进展密切相关[3]。本研究通过观察脓毒症急性肾损伤患者外周血单个核细胞(PBMCs)中NLRP3表达水平，分析其与疾病发生及进展的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年2月至2020年1月重庆市綦江区人民医院收治的脓毒症急性肾损伤患者154例作为脓毒症急性肾损伤组，普通脓毒症患者55例作为普通脓毒症组。脓毒症急性肾损伤组中男79例，女75例；年龄41～82岁，中位年龄60.5岁。普通脓毒症组中男29例，女26例；年龄42～81岁，中位年龄61.2岁。纳入标准：诊断脓毒症及脓毒症急性肾损伤患者均需满足脓毒症国际共识指南[4]；脓毒症急性肾损伤患者还需满足脓毒症急性肾损伤诊断标准[5]。排除标准：既往已存在肾功能不全的患者；合并自身免疫系统疾病的患者；合并恶性肿瘤的患者；近期有服用免疫抑制剂的患者。此外，选取同期门诊体检健康者50例为对照组。依据急性肾损伤诊断标准，包括血清肌酐(Cr)水平和尿量，将脓毒症急性肾损伤组分为Ⅰ期组(51例)、Ⅱ期组(52例)和Ⅲ期组(51例)。根据患者临床结局，分为存活组(124例)和死亡组(30例)。各组间及亚组间一般临床资料(包括性别、年龄等)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得了重庆市綦江区人民医院伦理委员会的批准。

1.2方法

1.2.1一般资料 患者入院24 h内收集一般临床资料，如性别、年龄、脓毒症感染病因(包括重症肺炎、腹腔感染、胆道感染、外科创伤及其他)等，检测患者肝功能、肾功能、血常规等指标，收集患者24 h尿量。

1.2.2分离外周血PBMCs 抽取静脉血2 mL，置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，随后加入等体积淋巴细胞分离液，经混匀后离心，分离得到PBMCs。

1.2.3PBMCs中NLRP3和半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1) mRNA相对表达水平的检测 采用qRT-PCR检测各组单个核细胞中NLRP3、Caspase-1的mRNA相对表达水平，具体步骤如下。在各组PBMCs试管中加入1 mL Trizol，经反复高速离心后提取总RNA，测定RNA含量。RNA反转录按反转录试剂盒(美国赛默飞公司)说明书进行。NLRP3上游引物为5′-CAT GAG TGC TGC TTC GAC AT-3′；下游引物为5′-GCT TCA GTC CCA CAC AGA-3′；Caspase-1上游引物为5′-ATC GCT TTC TGC TCT TCC AC-3′；下游引物为5′-TCC TCC ACA TCA CAG GAA CA-3′。内参GAPDH上游引物为5′-AGA CAG CCG CAT CTT CTT GT-3′；下游引物为5′-CTT GCC GTG GGT AGA GTC AT-3′。将反转录产物进行PCR反应，依据荧光定量PCR试剂盒说明书(美国赛默飞公司)建立25.0 μL反应体系，包括经焦碳酸二乙酯处理的水17.5 μL、10×Taq缓冲液2.5 μL、氯化镁2.0 μL、脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、Tap酶0.5 μL。扩增条件[6]：95 ℃预变性120 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40个循环。以ΔΔCt来计算mRNA相对表达水平。

1.2.4外周血炎性因子水平的检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组外周血白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，具体操作见试剂盒说明书(上海信帆生物公司)。简要步骤如下：取各组空腹静脉血4 mL，经1 500 r/min离心5 min后收集上清液；设置空白孔、标准孔及待测样品孔，空白孔仅加入显色液和终止液，标准孔加入不同水平标准品稀释液，而待测样品孔加入上清稀释液；经室温孵育、洗涤后，加入抗体工作液(100微升/孔)、显色液(100微升/孔)、终止液(50微升/孔)，最后测定各组吸光度(A)450值。

2 结 果

2.1对照组、普通脓毒症组及脓毒症急性肾损伤组各指标比较 普通脓毒症组和脓毒症急性肾损伤组外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β及TNF-α水平均明显高于对照组(P<0.05)；与对照组和普通脓毒症组比较，脓毒症急性肾损伤组上述指标明显升高(P<0.05)，见表1。

表1 对照组、普通脓毒症组及脓毒症急性肾损伤组各指标比较

2.2脓毒症不同感染病因患者之间各指标比较 脓毒症不同感染病因患者之间外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β及TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同病因脓毒症患者组间各指标比较

2.3脓毒症急性肾损伤不同分期组间各指标比较 根据脓毒症急性肾损伤病情严重程度，不同分期组间外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，Ⅲ期组上述指标水平最高，Ⅱ期组次之，Ⅰ期组最低(P<0.05)，见表3。

表3 脓毒症急性肾损伤不同分期组间各指标比较

2.4脓毒症急性肾损伤不同预后组间各指标水平比较 与脓毒症急性肾损伤存活组患者NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平比较，死亡组患者上述指标明显升高(P<0.05)，见表4。

表4 脓毒症急性肾损伤不同预后组间各指标水平比较

2.5相关性分析 相关性分析显示，脓毒症急性肾损伤患者NLRP3 mRNA水平与Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平呈正相关(r=0.802、0.720、0.621、0.633，P<0.05)。

2.6NLRP3 mRNA水平区分脓毒症是否并发肾损伤及评估脓毒症急性肾损伤组预后的ROC曲线分析 以NLRP3 mRNA相对表达水平区分脓毒症并发肾损伤与未并发肾损伤的AUC为0.787(95%CI：0.703～0.872)，最佳截断值为2.31，其灵敏度和特异度分别为74.51%和74.55%，其AUC稍大于Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β和TNF-α，但差异无统计学意义(P>0.05)；以NLRP3 mRNA相对表达水平区分脓毒症急性肾损伤组存活和死亡的AUC为0.872(95%CI：0.790～0.954)，最佳截断值为2.65，其灵敏度和特异度分别为85.00%和75.55%，其AUC明显大于Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注：A为区分脓毒症并发肾损伤与未并发肾损伤的ROC曲线；B为区分脓毒症急性肾损伤组存活和死亡的ROC曲线。

3 讨 论

急性肾损伤是脓毒症最严重的并发症之一，主要表现为肾功能进行性衰退，是预测脓毒症患者死亡的独立危险因素[7]。目前，随着相关临床研究的持续深入，已有研究者对常规指标如血清Cr及急性生理与慢性健康状况评分(APACHEⅡ)等在脓毒症急性肾损伤病情评估中的作用进行了相关研究，但上述指标灵敏度或特异度不高[8-9]。针对脓毒症急性肾损伤，如何通过有效的指标来评估其病情及预后，是临床面临的重大难题。

目前，脓毒症急性肾损伤的发病机制仍不明确，肾缺血再灌注损伤、氧化应激、内皮功能障碍及微小RNA等均可能参与了其发病过程[10-13]。随着近年来相关研究的深入，研究者发现，炎性反应的激活与放大是脓毒症发生及进展的重要因素，抑制炎性反应是脓毒症临床治疗的重要手段[14]。免疫炎性小体的激活是促进下游炎症级联反应的启动因子之一，在免疫炎性小体分类中，NLRP3是重要成员之一，参与了天然免疫系统的构建[15]。有研究者发现，NLRP3在细胞及动物实验中可激活下游Caspase-1/IL-1β及TNF-α通路，是促进炎性反应的重要信号通路之一，抑制NLRP3的激活，可抑制炎性反应的靶点[16]。NLRP3可表达于人体外周血PBMCs，通过检测PBMCs中NLRP3相对表达水平，可反映机体炎性反应强度。相关研究显示，在急性胰腺炎患者中，PBMCs中NLRP3 mRNA相对表达水平明显升高，其与患者病情严重程度及预后呈一定的相关性[17]。同样作为炎症性疾病之一，脓毒症急性肾损伤患者外周血PBMCs中NLRP3及下游信号通路水平如何，目前尚不明确。本研究结果显示，脓毒症急性肾损伤患者NLRP3及下游炎性信号通路呈明显激活状态，主要表现为外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达水平明显升高。进一步检测相关炎性细胞因子水平，外周血IL-1β和TNF-α水平也明显升高，与NLRP3和Caspase-1变化趋势一致。NLRP3炎性信号通路的激活，是脓毒症急性肾损伤病情进展的重要因素，通过检测不同严重程度患者NLRP3及下游相关指标水平，结果提示随着患者病情进展，上述指标水平均进行性升高。相关动物实验研究已表明，NLRP3的激活与急性肾损伤的作用机制与激活下游炎性通路，促进肾小管细胞发生凋亡或焦亡，破坏蛋白酶-抗蛋白酶平衡，降解细胞外基质有关[18-20]。既往发现的脓毒症急性肾损伤预后评估的相关指标如血清Cr、尿蛋白等，特异度相对偏低，本研究ROC曲线分析显示，NLRP3 mRNA对脓毒症急性肾损伤预后的评估价值较高，其AUC大于血清Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α指标。

综上所述，NLRP3下游信号通路的激活与脓毒症急性肾损伤的发生及病情进展密切相关，外周血PBMCs中NLRP3 mRNA相对表达水平不仅可作为患者预后的评估指标，还可能成为未来该类疾病治疗的靶点。但由于该研究入选患者样本量偏少，下一步需要扩大样本量，采取多中心联合的方式加以验证。