基于DNA-Ag/Pt双金属纳米簇比色法检测葡萄糖*

傅贤明 许丽兰 陈健敏

(1莆田学院药学与医学技术学院；2药物分析与检验医学福建省高校重点实验室 福建莆田 351100)

糖尿病是由胰岛素分泌缺陷或其生物功能受损而引起的代谢性疾病。糖尿病常带来一些并发症，如糖尿病神经病变、肾功能衰竭、糖尿病足、失明等，严重影响人们的健康和生活质量[1]。目前，糖尿病已成为世界范围内一个严重的公共卫生问题，患病率逐年上升。因此，如何快速、准确地检测人体血糖水平对糖尿病的早期诊断和治疗具有非常重要的意义。

传统的葡萄糖检测方法有旋光法、高效液相色谱法、气相色谱法等[2-8]，这些检测方法存在许多弊端，如需要大型的仪器设备作为支持，设备价格昂贵，测定成本较高；同时样品前处理及操作过程繁琐复杂，在测定的过程中容易受到污染或破坏，测定周期长及干扰大。近年来，简便快速、选择性好和灵敏度高的葡萄糖生物传感器逐渐成为研究的热点，科学家们开发了各种各样用于葡萄糖检测的传感器，包括光学、电化学、酶学等葡萄糖生物传感器[9～10]。其中比色技术是测定葡萄糖最简单方便的方法，因为它无需用到高端的仪器，人眼可以通过颜色变化直接识别[10]。

随着纳米技术的研究和发展，有些纳米材料逐渐被作为模拟酶来催化物质反应。和普通自然界的酶相比，纳米材料模拟酶可以克服天然酶的催化活性抑制、价格昂贵、稳定性低等缺点[11]，而且纳米材料模拟酶具有成本低、合成可控、化学性质稳定、催化活性高、使用条件范围广等显著优势[12]，因此纳米材料模拟酶的研究受到越来越多的关注，被广泛应用于环境保护、食品安全、临床检测及疾病治疗等方面[13-17]。

Zheng等人[18]以DNA为模板，成功合成DNA-Ag/Pt双金属纳米簇，发现该双金属纳米簇具有过氧化物模拟酶活性，能催化H2O2氧化TMB使溶液变蓝色。在此基础上，Fu[19～20]优化了DNA-Ag/Pt双金属纳米簇的合成条件，缩短了合成反应时间。合成出的双金属纳米簇具有粒径小、分散度好等优点，且表现出更强的模拟酶活性。文章基于合成的DNA-Ag/Pt双金属纳米簇具有过氧化物模拟酶的特性，构建了一种高灵敏检测葡萄糖的比色传感器。该传感器对葡萄糖的测定表现出高选择性和良好的重现性，具有潜在的实际应用价值。

1实验部分

1.1试剂与仪器

氯亚铂酸钾(K2PtCl4)，购自上海麦克林生化科技有限公司；葡萄糖氧化酶，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；硝酸银(AgNO3)、硼氢化钠(NaBH4)、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)、30%过氧化氢(H2O2)、柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、葡萄糖(C6H12O6·H2O)、蔗糖(C12H22O11)、D-果糖(C6H12O6)购自国药集团化学试剂有限公司；其它化学试剂均为分析纯；实验用水为Millipore Milli-Q系统净化的超纯水(18.2 M·cm)。

DNA序列由生工生物工程(上海)有限公司合成，用于合成Ag/Pt NCs的富含C碱基的模板DNA序列：5'-CCC CCT AAC TCC CCC-3'。

紫外可见分光光度计(UV-2550型)：日本岛津公司；台式微量高速离心机(H1650-W型)：长沙湘仪离心机仪器有限公司；恒温混匀仪(VS-100H型)：无锡沃信仪器有限公司；超声波清洗器(KQ116型)：昆山市超声仪器有限公司；精密酸度计(pHS-3B型)：上海雷磁仪器厂；电子天平(AR124CN型)：奥豪斯仪器有限公司。

1.2DNA-Ag/Pt NCs的制备

参照文献[19～20]的方法合成银铂双金属纳米簇。将10μL AgNO3(1 mmol/L)溶液、20μL K2PtCl4(3 mmol/L)溶液和10μL DNA(100μmol/L)溶液混合后，加入60μL柠檬酸三钠(10 mmol/L)溶液，暗处反应10 min后，加入100μL NaBH4(200μmol/L)溶液，混匀后，45℃金属浴5 min，取出，冷却至室温后得到 DNA-Ag/Pt NCs，15 000 rpm离心15 min，将溶液置于冰箱冷藏贮存备用。

1.3DNA-Ag/Pt NCs过氧化物模拟酶活性验证

取上述DNA-Ag/Pt NCs溶液10μL于离心管中，分别加入20μL H2O2(6 mmol/L)溶液、130μL HAc-NaAc缓冲液(200 mmol/L，pH 4.0)及40μL TMB(2 mmol/L)溶液。混匀后静置5 min，观察溶液颜色变化并扫描其紫外可见光谱图，记录652 nm处的吸光值。

1.4实验条件的优化

1.4.1 HAc-NaAc缓冲液pH优化 向离心管中分别加入130μL不同pH值的 HAc-NaAc缓冲液，然后依次加入10μL DNA-Ag/Pt NCs(5μmol/L)溶液、20μL H2O2(6 mmol/L)溶液和40μL TMB(2 mmol/L)溶液，混匀后静置5 min，用紫外可见分光光度计测量各溶液在652 nm处的吸光值，每组实验平行测定3次。

1.4.2 TMB浓度优化 向离心管中分别加入40μL不同浓度的TMB溶液，然后依次加入10μL DNA-Ag/Pt NCs(5μmol/L)溶液、130μL HAc-NaAc缓冲液(200 mmol/L，pH 4.0)和20μL H2O2(6 mmol/L)，混匀后静置5 min，用紫外可见分光光度计测量各溶液在652 nm处的吸光值，每组实验平行测定3次。

1.4.3 H2O2浓度优化 向离心管中分别加入20μL不同浓度的H2O2溶液，然后依次加入10μL DNA-Ag/Pt NCs(5μmol/L)溶液、130μL HAc-NaAc缓冲液(200 mmol/L，pH 4.0)和40μL TMB(2 mmol/L)。混匀后静置5 min，用紫外可见分光光度计测量各溶液在652 nm处的吸光值，每组实验平行测定3次。

1.5葡萄糖的检测

葡萄糖的检测分两步进行[21]，第一步先用PB缓冲液(10 mmol/L，pH 7.4)配制不同浓度的葡萄糖溶液，然后在离心管中加入上述葡萄糖溶液40μL，再加入10μL葡萄糖氧化酶(GOD，1 mg/mL)溶液，混匀后，置于37 ℃的恒温水浴锅中反应10 min。第二步，在上述装有反应液的离心管中，再加入10μL DNA-Ag/Pt NCs(5μmol/L)溶液、40μL TMB(2 mmol/L)溶液和100μL HAc-NaAc缓冲液(200 mmol/L，pH 4.0)，混匀后反应5 min，观察溶液颜色的变化，并用紫外可见分光光度计扫描其光谱图，记录652 nm处的吸光值。

2结果与讨论

2.1 DNA-Ag/Pt NCs的过氧化物模拟酶活性

由图1可知，DNA-Ag/Pt NCs的加入可促使TMB-H2O2体系发生明显的化学反应，溶液颜色变蓝色，且紫外可见光谱图上在370 nm和652 nm处出现了TMB被氧化后的特征吸收峰。而在TMB溶液中，若单独加入H2O2或DNA-Ag/Pt NCs溶液，都观察不到颜色变化和652 nm处的吸收峰。实验结果说明，在H2O2存在下，加入DNA-Ag/Pt NCs可以加速TMB的氧化反应并产生蓝色变化，即所合成的DNA-Ag/Pt NCs具有很好的过氧化物模拟酶催化活性。

图1 不同体系的紫外可见吸收光谱图：DNA-Ag/Pt NCs+TMB+H2O2(A)、TMB+H2O2(B)和DNA-Ag/Pt NCs+TMB(C)，插图为对应体系的溶液颜色

2.2实验条件的优化

DNA-Ag/Pt NCs的过氧化物模拟酶催化活性通常受外界因素的影响，为了得到最优的催化性能，对实验的反应条件进行了优化。在其它反应条件相同的情况下，首先考察了缓冲液pH值对催化性能的影响。如图2所示，相比于中性及弱碱性溶液，DNA-Ag/Pt NCs在酸性溶液中表现出更强的催化活性。当HAc-NaAc缓冲液的pH = 4.0时，DNA-Ag/Pt NCs催化H2O2氧化TMB在652 nm处有最大吸光值，因此后续实验中HAc-NaAc缓冲液的pH固定为4.0。

图2 缓冲液pH值对DNA-Ag/Pt NCs过氧化物模拟酶性能的影响

为了进一步提高DNA-Ag/Pt NCs的催化性能，对底物TMB的浓度进行了优化。如图3所示，在相同条件下，发现当TMB浓度为400μmol/L时，DNA-Ag/Pt NCs催化H2O2氧化TMB在652 nm处具有最大吸光值，因此确定TMB的浓度为400μmol/L。

图3 TMB浓度对DNA-Ag/Pt NCs过氧化物模拟酶性能的影响

在HAc-NaAc缓冲液pH = 4.0、TMB = 400μmol/L的条件下，考察了H2O2浓度对DNA-Ag/Pt NCs模拟酶催化性能的影响。图4给出了体系在不同浓度H2O2存在时652 nm处的吸光值。从图中可以看出，随着H2O2浓度的增加，吸光值也逐渐增大，即使H2O2浓度高达1200μmol/L，DNA-Ag/Pt NCs的催化活性也没有出现抑制现象，这表明DNA-Ag/Pt NCs具有稳定的催化能力。以吸光值对H2O2浓度作图，发现吸光值A与H2O2浓度c呈线性关系，线性方程为A = 4.652×10-4c + 0.041(R2= 0.9954)，说明DNA-Ag/Pt NCs模拟酶催化能力强弱在此范围内与H2O2的浓度大小成正比，由此可将之应用于H2O2的定量检测。

图4 H2O2浓度对DNA-Ag/Pt NCs过氧化物模拟酶性能的影响(红线为吸光值与H2O2浓度的线性曲线)

2.3葡萄糖的检测

在氧气存在下，葡萄糖氧化酶(GOD)能催化氧化葡萄糖产生H2O2和葡萄糖酸[21]，由上述结论可知，DNA-Ag/Pt NCs模拟酶催化能力强弱在一定范围内与H2O2的浓度大小成线性关系，并可将之用于H2O2的定量检测。在此，设计了一个比色传感器用于葡萄糖的间接检测，原理如下：葡萄糖在GOD存在时会氧化产生H2O2，利用DNA-Ag/Pt NCs过氧化物模拟酶活性可定量检测葡萄糖氧化产生的H2O2，从而间接实现对葡萄糖的检测。

为了验证所设计的比色传感器的可行性，做了如下对照实验。图5展示的是DNA-Ag/Pt NCs在TMB-H2O2体系中的紫外可见光谱图(A线)和经GOD催化氧化后的葡萄糖溶液替代H2O2后体系的紫外可见光谱图(B线)。对比这两条线，可以看出，它们峰的形状和位置都一模一样，而且用经GOD催化氧化后的葡萄糖溶液替代H2O2后，溶液也出现了TMB显色反应特有的浅蓝色，这些都说明该比色传感方法是可行的。

图5 不同体系的紫外可见吸收光谱图：DNA-Ag/Pt NCs+TMB+H2O2(A)和DNA-Ag/Pt NCs+TMB+(glucose+GOD)(B)，插图为对应体系的溶液颜色

图6(A)给出了不同浓度葡萄糖存在时体系的紫外可见吸收光谱图。由图可知，652 nm处的吸收峰强度随着葡萄糖浓度的增加而逐渐增加。图6(B)为相应的652 nm处的吸光值与葡萄糖浓度的关系曲线图。当葡萄糖浓度在400～900μmol/L范围内，吸光度A与葡萄糖浓度c呈良好的线性关系(图6(B)插图)，线性方程为A = 0.00029c-0.00912，R2= 0.9968，检测限为200μmol/L(信噪比S/N = 3)。据报道，吴远亚[22]合成了氮、硫、铁等多元素共掺杂的碳量子点，将该量子点修饰电极并用于检测葡萄糖，检测范围为1～15 mmol/L，检测限为0.33 mmol/L；Jiang[23]合成了去铁铁蛋白-金纳米簇(Au-Ft)并将之用于葡萄糖的检测，检测范围为2～10 mmol/L，检测限为2.0 mmol/L；戴煌[24]在基于纳米通道内双酶催化聚合物生长的葡萄糖检测研究中，测得该法的葡萄糖检测范围为8～20 mmol/L，检测限为4.36 mmol/L；戴煌[24]在基于纳米通道内酶-催化-诱导制备无机纳米粒子的葡萄糖检测研究中，测得该法对葡萄糖检测范围为12～30 mmol/L，检测限为11.60 mmol/L。与上述文献报道的方法相比，该实验基于DNA-Ag/Pt NCs比色法检测葡萄糖具有相对更高的分析灵敏度。另外，对600μmol/L的葡萄糖进行8次平行测量，计算得到相对标准偏差RSD = 3.22%，说明所设计的比色传感器对葡萄糖测定具有较好的重现性。

图6 (A)不同浓度葡萄糖的紫外可见吸收光谱图，a→j：200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100μmol/L；(B)652nm吸光值与葡萄糖浓度的关系曲线，插图为吸光值与浓度的线性曲线

2.4选择性实验

为了评估传感器对葡萄糖的选择性，采用相同的检测方法对900μmol/L的葡萄糖以及浓度为葡萄糖浓度5倍(4.5 mmol/L)的同类干扰物质蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖进行检测比对。如图7所示，尽管其它糖的浓度为葡萄糖的5倍，但葡萄糖的吸光值明显最大，是其它糖类吸光值的9.6～16.5倍，这主要归功于葡萄糖氧化酶对葡萄糖具有高度特异性，与其它糖类不起反应。因此，这些同类物质对葡萄糖检测的干扰可忽略不计，说明该比色传感器对葡萄糖的测定具有很好的专一性。

图7 传感器对葡萄糖的选择性研究(葡萄糖浓度：900μmol/L，其他糖类浓度：4.5 mmol/L)

2.5实际样品的检测

为了进一步探究该传感器在实际应用中的可行性，进行了人血清样品葡萄糖的分析检测。血清样品由附属医院提供，并事先用全自动生化分析仪(Roche Cobas 8000)测定了葡萄糖的浓度。血清样品用传感器检测前先稀释10倍，以使浓度落在传感器的线性范围内。对同一份血清样品进行了3次重复检测，结果如表1所示。传感器的检测结果与医院提供的结果基本一致，说明此传感器可用于实际样品中葡萄糖的测定。

表1 血清样品中葡萄糖浓度的检测

3结论

DNA-Ag/Pt NCs具有过氧化物模拟酶活性，能催化H2O2氧化TMB产生蓝色反应，且催化能力在一定范围内与H2O2浓度大小成正比。利用该特性，设计了一个比色传感器用于葡萄糖的检测。在最优实验条件下，该传感器对葡萄糖的检测范围为400～900μmol/L，检测限为200μmol/L，且传感器对葡萄糖的检测具有高度专一性，其它糖类对检测的干扰可忽略不计。在人血清样品葡萄糖浓度的检测中，传感器的检测结果与医院的结果基本一致。这些都说明了该比色传感器可用于葡萄糖的分析检测。该方法具有操作简单方便、灵敏度高、选择性好等优点，在生物医学、环境化学和食品检测等领域具有潜在的应用价值。