水中细菌ATP荧光检测影响因素实验研究

王秋华，许元龙，王璐璐，张卫风

(华东交通大学 土木建筑学院，江西 南昌 330013)

饮用水输布过程中，微生物会利用水中营养物质生长繁殖，形成的生物膜会保护致病菌，严重威胁饮用水安全[1]。ATP荧光检测法作为水中细菌含量的主要评价方法[2-6]，具有快速、廉价、操作简单，且可在低水平下检测(浓度为1 ng/L的ATP不需浓缩，可直接检测)的优势，因而具有广阔的应用前景[7-9]。Van等采用ATP、AOC等多个指标测定慢沙过滤后成品水的微生物生长潜力，发现ATP与AOC相关性良好[10]。

本文主要研究了发光反应条件、水质条件和试剂存放条件对测试结果的影响，以期可更好地利用ATP发光检测技术确定饮用水的生物稳定性。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

FeSO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、NaCl、NaAc·3H2O均为分析纯；螺旋菌NOX(Spirillumsp.)，购自北纳生物微生物菌种保藏中心；ATP可检测试剂，由BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate的混合液组成；GLOMAXTM20/20检测试剂，购自 Promega 公司。

GLOMAXTM20/20发光检测仪。

1.2 实验方法

1.2.1 2 000 μg/L碳当量培养液的配制 2 000 μg/L碳当量的培养液配方见表1。按照配方溶解药品，并定容到1 L。将培养液分装到200 mL的锥形瓶中，每瓶10 mL，在115 ℃灭菌20 min。

表1 2 000 μg/L碳当量的培养液配方

1.2.2 细菌培养液制备 将NOX菌落接种到 2 000 μg/L 碳当量的培养液中，37 ℃恒温培养 16 d，低温4 ℃冷藏保存3个月，作为细菌培养液。

1.2.3 实验方法 利用GLOMAXTM20/20发光检测仪测试ATP指标。测试结果有两种表达方式。其中一种方式是ATP产生的荧光相对发光强度RLU；另一种方式是通过测试已知量的ATP标样的相对发光强度，将测试样发光强度转换成ATP物质的量(nmol/L)。本文采用RLU值表示ATP。

1.2.3.1 常规检测方法 室温条件下，按照说明要求将BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate两种测试试剂混合。取定量配好后的测试试剂，加入样品混合5 min后的读数，即是所测相对发光强度(RLU)值。

常规ATP检测，发光试剂与样品的发光反应时间需要5 min，才会得到稳定的相对发光强度读数。读数并不影响发光反应进行，所以为了尽量缩短ATP测试时间，将试剂与水样混合后直接采用间隔5 s连续读数的方式。本实验采用改进的ATP检测方法。

1.2.3.2 改进ATP检测方法 如上配好试剂并加样后，立即将混合液放入仪器中连续读数，设置间隔5 s，连续手动读数模式，记录数据。

2 结果与讨论

2.1 发光反应条件的影响

25 ℃条件下，分别将 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL 原菌液与50 μL检测试剂在1.5 mL的灭菌离心管中混合，立即放入GLOMAXTM 20/20发光检测仪进行检测，得到1.5 μL和2.5 μL原菌液测试发光反应到稳定期的两条数据记录曲线(图1)，和发光反应5 s结果(图2，第1次读数结果)与发光最大值(图3，发光稳定期内，在每组连续6次读数中，当第一个读数为最大值时，即将其定为最大值)结果的两条标准曲线。

图1 细菌培养液ATP荧光检测结果

由图1可知，菌液添加量为1.5 μL样品的相对发光强度在前3次读数过程中快速上升至 7 418 RLU，随后上升速度减缓，并于第8次读数时开始稳定在8 501 RLU左右。菌液添加量为2.5 μL样品的相对发光强度在前3次读数中迅速增至 11 761 RLU，随后增加趋势减缓，并于第9次读数后稳定在 13 482 RLU 附近。虽然菌液量不同，但相对发光强度的变化趋势与达到稳定的时间均相似，即ATP试剂与样品的发光反应初期发光强度迅速变大，反应到达一定程度后，发光强度基本保持恒定。

同一次测试的结果得到图2、图3两条菌量与ATP相对发光强度标准曲线。图2是根据5 s读数建立的，图3是根据最大值读数建立的。结果表明，虽然发光反应初期光强增长剧烈，但对其发光强度与菌量间的相关性影响很小。即使发光反应仅有 5 s 时，其相对发光强度值和细菌量的标准曲线的R2值仍达到0.979 04，5 s读数能够在一定程度上表征细菌量，并且使ATP测试时间显著缩短。图3是根据最大值建立的细菌量与ATP相对发光强度值的标准曲线，其R2值为0.993 89。通过比较5 s发光值(图2)和最大发光值(图3)与细菌ATP的标准曲线，发现最大值标准曲线的拟合度更好，更能准确反应ATP相对发光强度与菌量的关系。

图2 5 s发光值与接种菌液量拟合结果

图3 最大发光值与接种菌液量拟合结果

2.2 水质条件的影响

水质三个类型分别是纯水(JC)、龙头水(L)及细菌培养液(J)。对于龙头水的测试，采用接菌龙头水(JL)减去接种前龙头水(L)数据的方法，去掉龙头水原本所含细菌的量的影响，即为折算接菌龙头水(JL-L)。每种水质重复实验3次。对于接菌纯水和接菌龙头水，水样与其所加细菌培养液的比值为200 μL∶10 μL，ATP检测试剂与加样的比值为 50 μL∶50 μL；对于不接菌龙头水，ATP检测试剂与加样的比值为50 μL∶50 μL；对于细菌培养液，ATP检测试剂与加样的比值为50 μL∶2.5 μL；每种水样的检测设3次重复。这样的试验设计，保障了龙头水、纯水及细菌培养液每次检测样本的菌量都为 2.5 μL 细菌培养液，其检测结果对应的是相同的细菌菌量。结果见表2。

表2 水样ATP荧光检测活力结果

由表2可知，3次重复测试结果的变化幅度龙头水为106 RLU，接菌龙头水为1 568 RLU，接菌纯水为963 RLU，细菌培养液为528 RLU，表明所测样品中细菌活力的稳定性由强到弱依次是龙头水>细菌培养液>接菌纯水>接菌龙头水。未接菌龙头水和细菌培养液的测试结果变化幅度相对较小，两者所含细菌都是经过长期生长稳定后的状态，细菌的活力基本保持在稳定值范围内。而接菌龙头水和接菌纯水的变化幅度都较大，说明细菌进入新的生长环境后，其生长活力会发生变化，变化幅度与水质因素有关系。

此外，表2列出了各水样ATP检测的平均值，其中接菌龙头水(JL)为 18 534 RLU，折算接菌龙头水(JL-L)为 16 524 RLU，接菌纯水(JC)为 23 609 RLU 及细菌培养液(J)为13 820 RLU。虽然折算接菌龙头水、接菌纯水及细菌培养液所测样品中的细菌含量相同，但三种水样的测试结果却有明显差异。接菌龙头水未减去本身所含细菌量时，其测试值就明显小于接菌纯水的测试值，这证明并不是龙头水本身所含菌量导致上述明显差异。并且相比于接菌龙头水和折算接菌龙头水，接种纯水与细菌培养液间的差异更大。可知水质对ATP检测结果会有明显影响，并且纯水对其影响的程度要大于龙头水。分析导致这个现象的原因，应是细菌接种到新环境中，其能量代谢系统受到营养条件变化的影响，从而导致细菌ATP量发生变化。

2.3 试剂存放条件的影响

检测试剂采用BacTiter-GloTMBuffer和BacTiter-GloTMSubstrate的混合液，室温下使用。现配试剂与连续使用试剂(25 ℃，光照2 d)对不同浓度菌液进行ATP荧光检测，结果见图4。

图4 不同试剂存放条件的ATP荧光检测结果

由图4可知，在接种1 μL菌液条件下，采用连续使用的检测试剂所得检测结果为6 057 RLU，而采用现配试剂的检测结果为 10 453 RLU，相差 4 396 RLU。随着接种量的增加，两种试剂的检测差值由4 396 RLU增加至13 787 RLU，即连续使用的试剂检测结果比现配试剂检测结果低了40%～50%。表明室温有光条件下，长时存放检测试剂会显著降低ATP荧光检测的发光强度，导致错误判断饮用水中生物量。考虑到检测试剂的发光能力在连续使用中会衰变，建议检测样本的同时，定时利用标样建立标准曲线，依据曲线的转换系数，将每个时段所测的相对发光强度换算为ATP物质的量，以ATP物质的量作为生物量指标。

3 结论

研究了检测发光时间、水质条件及试剂存放条件对ATP荧光检测准确性的影响。在25 ℃条件下，采用5 s间隔连续读数方式，记录最大值作为测试结果。这种读数方式既可以节省测试时间，又能够保证测试准确性。测试时若需要稀释，稀释用的溶剂会在一定程度上干扰测试结果。不同水质会导致ATP测试结果的差异，这个发现对于研究水质生物稳定性具有一定意义。鉴于ATP试剂会因存放条件而衰变，在一定时间和温度条件下，增加对ATP标样相对发光强度的检测，将相对发光强度转化成ATP物质的量，并以此作为生物量的表征指标。