低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡生长性能、肝脏生长基因及雷帕霉素靶蛋白信号通路基因表达的影响

张静静 郑 旭 李 玥 朱随亮 王世琼 张 薇 乔英英 刘长忠 王志祥*

(1.河南农业大学动物科技学院，郑州 450002；2.河南科技学院，新乡 453003)

近年来，低碳养殖受到人们的高度重视，2018年10月26日，中国饲料工业协会发布了《仔猪、生长育肥猪配合饲料》和《蛋鸡、肉鸡配合饲料》2项团体标准，这2项标准的重点是降低饲粮中粗蛋白质水平，提倡高度有效的低蛋白质饲粮体系在畜牧业中的应用，推动养殖业绿色发展。低蛋白质饲粮是一种通过降低饲粮2～4个百分点粗蛋白质水平，并通过添加适宜种类和比例的氨基酸，对动物生长性能不造成影响的氨基酸平衡饲粮[1]。研究表明，酶制剂应用在配合饲料中对动物的生产性能有提高的作用，不仅可以减少蛋白质原料的使用，节约饲料成本，提高饲粮粗蛋白质的利用率，提高经济效益，而且也能减少氮排放对环境造成的污染[2-3]。饲粮添加外源蛋白酶对畜禽的生长尤其幼龄动物有良好的作用效果[4]。不过，目前尚不明确蛋白酶是如何通过影响肉仔鸡分子机制的表达，从而调控其生长性能。因此，本试验通过检测肉仔鸡血清生化指标、肝脏关键生长基因及骨骼肌雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)信号通路相关基因的表达，进一步探究蛋白酶的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取1日龄爱拔益加(AA)白羽肉仔鸡324只，随机分为3个组，每组6个重复，每个重复18只鸡(公母各占1/2)。对照组饲喂基础饲粮(前期粗蛋白质水平为23%，后期粗蛋白质水平为20%)；低蛋白质组(前期粗蛋白质水平为21%，后期粗蛋白质水平为18%)补充L-赖氨酸盐酸盐、DL-蛋氨酸和L-苏氨酸达到AA肉仔鸡饲养标准；低蛋白质加酶组在低蛋白质组饲粮基础上添加500 mg/kg蛋白酶(蛋白酶由上海某生物技术有限公司提供，主要是从猪胰腺组织中提取的胰蛋白酶，酶活性为30 000 U/g)。饲粮组成及营养水平见表1。试验期42 d。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) %

续表1项目 Items1～21日龄 1 to 21 days of age对照组 Control group低蛋白质组 Low protein group22～42日龄 22 to 42 days of age对照组 Control group低蛋白质组 Low protein group蛋氨酸 Met0.500.510.410.41赖氨酸 Lys1.201.201.101.10苏氨酸 Thr0.860.800.740.72

1.2 饲养管理

试验鸡采用3层立笼式养，1～7日龄每笼放18只鸡，8～25日龄每笼9只，26～42日龄每笼6只。育雏期温度维持在33～35 ℃，之后通过自由通风、风机和湿帘来降温，直到22日龄以后温度保持在24～26 ℃，相对湿度在65%～70%。试验期间鸡只自由采食、饮水，自然光照和人工补光相结合，饲养管理和免疫按常规程序进行。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长性能

分别于1、21和42日龄对肉仔鸡进行称重，试验期间以重复为单位记录每个阶段的耗料量，计算每个阶段鸡只的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

平均日增重=(末重-初重)/
(试验天数×鸡只数)；
平均日采食量=总耗料量/
(试验天数×鸡只数)；
料重比=平均日采食量/平均日增重。

1.3.2 血清生化指标

试验第43天，每重复挑选1只接近平均体重的鸡，颈静脉采血5 mL放入促凝管，3 500 r/min离心15 min分离血清，将分离的血清分装到1.5 mL离心管中，放入-20 ℃保存备用。采用全自动血清生化分析仪(Beckman Coulter-AU5800，日本)测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性以及总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、尿素氮(UN)、尿酸(UA)和总胆固醇(T-CHO)含量。

1.3.3 肝脏关键生长基因及胸肌和腿肌TOR信号通路相关基因表达

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较。结果以平均值±标准差表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响

由表3可知，与低蛋白质组相比，低蛋白质加酶组肉仔鸡21和42日龄体重以及1～21日龄和1～42日龄平均日增重显著提高(P<0.05)，1～21日龄料重比显著降低(P<0.05)；并且，与对照组相比，低蛋白质加酶组肉仔鸡1～21日龄平均日增重显著提高(P<0.05)，1～21日龄料重比显著降低(P<0.05)；低蛋白质组肉仔鸡1～21日龄平均日采食量显著低于对照组(P<0.05)，其他生长性能指标与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。

表3 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响Table 3 Effects of protease supplementation in low protein diet on growth performance of broilers

2.2 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡胸肌率和腿肌率的影响

由表4可知，与低蛋白质组相比，低蛋白质加酶组肉仔鸡胸肌率和腿肌率显著提高(P<0.05)，且与对照组相比差异不显著(P>0.05)；低蛋白质组肉仔鸡胸肌率和腿肌率与对照组相比无显著差异(P>0.05)。

表4 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡胸肌率和腿肌率的影响Table 4 Effects of protease supplementation in low protein diet on chest muscle rate and leg muscle rate of broilers %

2.3 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡血清生化指标的影响

由表5可知，与低蛋白质组相比，低蛋白质加酶组肉仔鸡血清总胆固醇含量显著降低(P<0.05)，血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶活性以及总蛋白、白蛋白、球蛋白和尿酸含量差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，低蛋白质加酶组肉仔鸡血清尿素氮含量显著降低(P<0.05)，低蛋白质组和低蛋白质加酶组血清尿酸含量均显著降低(P<0.05)，低蛋白质组血清总胆固醇含量显著提高(P<0.05)。

表5 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡血清生化指标的影响Table 5 Effects of protease supplementation in low protein diet on serum biochemical parameters of broilers

2.4 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡肝脏关键生长基因表达的影响

由图1可知，与低蛋白质组相比，低蛋白质加酶组肉仔鸡肝脏胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP1)基因表达量显著降低(P<0.05)，肝脏胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、生长激素(GH)和生长激素受体(GHR)基因表达量显著提高(P<0.05)，肝脏胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因表达量差异不显著(P>0.05)；低蛋白质加酶组肉仔鸡肝脏IGFBP1基因表达量显著低于对照组(P<0.05)，肝脏IGF-ⅠR基因表达量与对照组相比差异不显著(P>0.05)；低蛋白质组肉仔鸡肝脏IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR、IGFBP1、GH和GHR基因表达量与对照组相比均没有显著差异(P>0.05)。

2.5 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡胸肌和腿肌TOR信号通路基因表达的影响

由图2、图3可知，与低蛋白质组相比，低蛋白质加酶组肉仔鸡胸肌TOR、核糖体蛋白S6激酶β1(S6K1)及腿肌S6K1、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)基因表达量显著提高(P<0.05)，胸肌4E-BP1及腿肌TOR基因表达量差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，低蛋白质组和低蛋白质加酶组肉仔鸡胸肌和腿肌TOR、S6K1和4E-BP1基因表达量均未见显著差异(P>0.05)。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

图2 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡胸肌TOR信号通路基因表达的影响Fig.2 Effects of protease supplementation in low protein diet on expression of TOR signaling pathway genes in chest muscle of broilers

图3 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡腿肌TOR信号通路基因表达的影响Fig.3 Effects of protease supplementation in low protein diet on expression of TOR signaling pathway genes in leg muscle of broilers

3 讨 论

3.1 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡生长性能的影响

饲粮中过高的蛋白质不能被动物完全消化，这不仅造成蛋白质原料的浪费，还会引起肠道健康问题。低蛋白质饲粮不影响甚至可改善肉鸡生长性能。研究发现，肉鸡饲粮粗蛋白质水平较NRC标准全期降低1～2个百分点，并通过添加赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸满足肉仔鸡营养需要，不仅不会对其生长性能产生不良影响，而且能显著降低氮的排放，减少环境污染[5]。Waguespack等[6]研究发现，将饲粮粗蛋白质水平从22.0%降至19.5%，补充适量的合成氨基酸，能够提高罗斯(Ross)708肉鸡1～18日龄的生长性能，使其达到高蛋白质组水平。Abdel-Maksoud等[7]在1～18日龄科宝(Cobb)500肉鸡上的研究也得到了相同的试验结果。本试验结果表明，饲粮粗蛋白质水平降低2个百分点，同时补充L-赖氨酸盐酸盐、DL-蛋氨酸和L-苏氨酸达到肉仔鸡饲养标准(低蛋白质组)，其生长性能能够达到对照组水平。可能是补充的氨基酸水平满足了机体生长发育的需要，因而不会损害其生长性能。近年来，蛋白酶作为一种高效的生物催化剂应用在畜禽饲料中，在提高饲粮蛋白质的利用率、改善生长性能等方面具有重要作用[8]。Wang等[9]研究表明，饲粮添加角蛋白酶可使肉仔鸡1～21日龄的体增重得到提高，并且改善了1～42日龄的料重比。Yu等[10]研究证实，在玉米-豆粕型饲粮中添加蛋白酶可以提高肉鸡的生长性能，改善饲料转化率。本试验结果表明，饲粮添加蛋白酶显著提高了肉鸡的体重和平均日增重，显著降低了1～21日龄的料重比。可能是蛋白酶的使用促进了肉仔鸡对饲粮中不可消化大分子营养物质的分解，供其吸收利用，从而改善生长性能。Inborr等[11]研究证明，大多由微生物发酵产生的酶制剂，为了满足其自身结构的需求，而且随着其分解物质的增加会反馈性刺激机体内消化酶的分泌，会提高对蛋白质的利用率，从而有效地改善动物生长性能。

3.2 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡血清生化指标的影响

血清总蛋白和白蛋白含量是表示体内蛋白质吸收与代谢情况的2个重要指标[12-13]。血清中的尿素氮含量与机体蛋白质和氨基酸的代谢呈明显的负相关关系，可以明确反映出机体内蛋白质代谢和各种氨基酸平衡的状况。血清尿酸是反映机体氮利用率的指标，其含量与氮的利用率呈负相关关系[14]。血清胆固醇可以反映机体对脂质代谢的状况。天门冬氨酸转移酶、丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶是衡量肝功能的主要指标。余红心等[15]研究发现，饲粮粗蛋白质水平对血清中的各项生化指标均没有显著影响。田丽新等[16]在肉鸡上的研究发现，分别将饲粮粗蛋白质水平降低1.5和3.0个百分比，血清中的总蛋白、白蛋白和球蛋白含量均没有发生显著变化，但是却显著降低了21日龄时血清的尿素氮含量。段晓翔等[17]研究表明，降低饲粮粗蛋白质水平可以不同程度地降低肉仔鸡42日龄血清中的尿素氮和尿酸含量。卢晨[18]研究证实，饲粮添加适量的中性和酸性蛋白酶能够不同程度地降低血清中的尿素氮含量，其中80 mg/kg中性蛋白酶和40 mg/kg酸性蛋白酶联合添加显著降低血清尿素氮含量。刘胜利等[19]研究表明，饲粮添加适量的蛋白酶(100、200和400 mg/kg)能够降低肉鸡血清中的尿酸含量。本试验中，各组之间肉仔鸡血清总蛋白、白蛋白含量及天门冬氨酸转移酶、丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶活性均没有显著差异，但降低饲粮粗蛋白质水平会显著降低血清中的尿酸含量，并且低蛋白质加酶组血清尿素氮含量显著降低，低蛋白组血清尿素氮含量有降低的趋势，但与对照组差异不显著，这与之前的研究结果较为一致。这表明肉仔鸡的肝脏没有受到损害，对蛋白质和氨基酸的分解率低，氨基酸平衡状况良好。但本试验结果发现，降低饲粮粗蛋白质水平会使血清总胆固醇含量显著升高，添加蛋白酶后血清总胆固醇含量与对照组相比无显著差异。Jiang等[20]研究发现，当饲粮粗蛋白质水平从22%降低至16%时，北京鸭血浆总胆固醇含量会提高。可能是由于低蛋白质饲粮中理想的蛋白质比例降低了氮排泄所需的能量，使更多的能量沉积在脂肪组织中。王俊花等[21]在伊犁鹅的研究中也发现，饲粮分别添加0.2、0.3和0.4 g/kg的复合酶制剂(主要成分为蛋白酶、α-淀粉酶和纤维素酶等)，血清总胆固醇含量均有下降的趋势，而且添加0.3 g/kg的复合酶制剂显著降低血清总胆固醇含量。可能是因为酶制剂的使用降低了肠道内容物的黏滞性，促进了脂类物质的分解，从而降低了机体内总胆固醇含量[22-23]。

3.3 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡肝脏关键生长基因表达的影响

肝脏分泌的胰岛素样生长因子，也称为生长介素，是生长激素轴的一种重要内分泌激素，在动物的生长发育过程中起着重要作用。饲粮中的营养物质能够调节IGF-Ⅰ基因的表达，从而影响动物的生长、代谢。吴凡等[24]在中华鳖上的研究中发现，随着饲粮中粗蛋白质含量的增加，会显著提高肝脏IGF-Ⅰ基因的表达水平。这说明蛋白质作为重要的营养物质，显著影响了肝脏中IGF-Ⅰ基因的表达，这与柳阳[25]在大西洋鲑上的研究结果一致。GH处于生长轴的中心环节，是整个生长轴上最重要的激素，是调控动物生长的关键因子，能够刺激骨骼和软骨的生长，促进动物机体的发育[26-27]。GH基因需要与靶器官上的相应受体结合，才可以产生生物学效应。因此，动物组织器官的发育和生长快慢，主要取决于靶细胞上GHR基因表达，组织中GHR的功能与含量直接影响了GH发挥其生理效应，从而影响动物的生长发育模式。饲粮的营养水平直接影响了动物生长轴相关激素的表达。丁玉华[28]研究了营养对生长基因的表达调控，结果表明饲喂低色氨酸饲粮的仔猪肝脏中GHR的mRNA表达量显著降低。Radcliff等[29]研究发现，饲喂高营养饲粮组的犊牛肝脏中GHR和IGF-Ⅰ基因表达量显著提高。姜洋洋等[30]研究了妊娠藏母羊饲粮蛋白质水平对初生羔羊机体内GH基因表达的影响，通过饲喂蛋白质水平分别为7.5%和13.5%的饲粮，结果表明，7.5%蛋白质组羔羊肝脏中GH基因表达量显著低于13.5%蛋白质组。胰岛素样生长因子可以通过胰岛素样生长因子结合蛋白转运至全身组织细胞，并与对应胰岛素样生长因子受体结合，促进组织细胞生长与分化，进而起到对动物生长发育的调控作用[31-33]。胰岛素样生长因子结合蛋白会抑制胰岛素样生长因子的活性，IGFBP1通过与IGF-ⅠR竞争性结合IGF-Ⅰ从而抑制IGF-Ⅰ的活性[34]。研究发现，在某些胁迫条件(如禁食、营养不良和蛋白质限饲)条件下，在转录水平上会诱导IGFBP1基因的高表达。Takenaka等[35]在小鼠上的试验研究表明，在氨基酸不足的条件下，IGFBP1基因的表达量提高。同样，在斑马鱼胚胎中IGFBP1的过表达会导致胚胎发育延缓[36]。这些研究均表明IGFBP1在机体的生长发育过程中具有重要作用。本试验中，低蛋白质组肝脏中关键生长基因的表达量与对照组没有显著差异，说明调整氨基酸平衡保证了饲粮供给的氨基酸营养需要，而添加蛋白酶显著提高了肉仔鸡肝脏中IGF-Ⅰ、GH和GHR基因的表达量，显著降低了肝脏中IGFBP1基因的表达量。关于蛋白酶对生长基因的表达还未见报道，可能是由于添加蛋白酶提高了肉仔鸡的体重和平均日增重，从而提高了肝脏关键生长代谢基因的表达，这与生长性能结果相吻合。

3.4 低蛋白质饲粮添加蛋白酶对肉仔鸡胸肌和腿肌TOR信号通路基因表达的影响

TOR参与调节肌肉蛋白质合成与降解的动态平衡，在骨骼肌蛋白质沉积起着关键作用[37]。TOR既是一种蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇相关蛋白激酶家族成员，也是一种重要的信号传导分子，是调节细胞生长周期和生长信号的一个中心环点[38]，在蛋白质合成过程中也起着较为关键的作用。TOR可以与几种蛋白质相互作用，形成在生物及功能上迥然不同的2种蛋白质复合物，即雷帕霉素靶蛋白复合物l(target of rapamycin complex 1,TORC1)与雷帕霉素靶蛋白复合物2(target of rapamycin complex 2,TORC2)。其中，TORC1对雷帕霉素敏感，参与营养物质、生长因子、能量应激、缺氧和机械应变等刺激产生响应，是一种关键的合成代谢细胞内信号转导机制[39]。TORC1由TOR、TOR调控相关蛋白(regulatory-associated protein of TOR，Raptor)及G蛋白β亚基样蛋白(G protein β-subunit-like protein，GβL)组成。TORC1最具特征的2个下游靶标是S6K1和4E-BP1。S6K1对蛋白质的合成具有正向调控作用。4E-BP1是mRNA 5′端帽结构结合蛋白——真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)的抑制因子。S6K1处于非磷酸化状态时，与真核起始因子3(eukaryotic initiation factor,eIF3)高度亲和，此时S6K1处于失活状态，当TOR受到外部条件的刺激被激活以后，TOR与S6K1竞争结合eIF3，S6K1发生磷酸化并激活S6K1使之成为有活性的状态，与S6核糖体有关的成分起作用后，将会磷酸化核糖体蛋白S6，使得mRNA的翻译功能效率提高，特别是与蛋白质合成编码相关蛋白的mRNA[40]。此外，非磷酸化形式的4E-BP1与eIF4E紧密相关，该蛋白和40S核糖体与mRNA链上的5′端帽结构mRNA的翻译有关。这种结合抑制了eIF4E，但是磷酸化的4E-BP1将从eIF4E中释放出来，从而使其他翻译起始因子(如真核起始因子4G)能够与eIF4E结合形成复合物，进而提高mRNA的翻译起始效率，加速蛋白质合成[41]。研究发现，一些营养因子，特别是氨基酸，可以通过TOR信号通路激活TORC1的活性，调控组织蛋白质的合成，提高饲粮中蛋白质的利用效率[42]。Torrazza等[43]研究表明，在低蛋白质饲粮中添加亮氨酸激活了TOR信号通路，提高了下游信号分子S6K1和4E-BP1基因的表达水平，能够达到高蛋白质组的效果。本试验中，与对照组相比，低蛋白质组肉鸡胸肌和腿肌TOR、S6K1和4E-BP1基因表达量差异不显著，与上述研究结果相一致；而低蛋白酶加酶组肉鸡胸肌或腿肌TOR、S6K1和4E-BP1基因表达量较低蛋白质组有所提高，说明蛋白酶的使用增加了蛋白质在骨骼肌中的沉积，这与胸肌率和腿肌率显著提高的结果相符合。本试验结果与Rayan等[44]在肉鸡上的试验结果较为一致，他们的研究表明，在肉鸡饲粮中添加200 mg/kg复合蛋白酶制剂，可将胸肌率提高7.5%。杜红方等[45]的研究也发现，在肉鸡饲粮中添加500 g/t的复合酶制剂(含蛋白酶、木聚糖酶和纤维素酶等)对胸肌率、腿肌率均有改善的作用，可将胸肌率、腿肌率分别提高3.88%、6.57%。

4 结 论

① 低蛋白质饲粮添加500 mg/kg蛋白酶能够提高肉仔鸡的平均体重，降低1～21日龄料重比。

② 低蛋白质饲粮添加蛋白酶能够提高肉仔鸡肝脏关键生长基因IGF-Ⅰ的表达量，降低肝脏IGFBP1的表达量，并通过激活TOR信号通路，提高骨骼肌中TOR、S6K1及4E-BP1的表达量，从而促进蛋白质的合成，提高肉仔鸡生长性能。