间接法测定反刍动物甲烷排放量的研究进展

贾 鹏 董利锋 屠 焰 刁其玉*

(1.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 100081；2.兰州大学草地农业科技学院，兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室，兰州 730020)

1999—2006年，全球范围内大气中的甲烷摩尔比例相对稳定，但从2006年开始，大气中甲烷(CH4)的比例以每年4～12 nmol/mol的速率持续增加。对环境中CH4进行同位素分析表明，2006年以后CH4排放量增加的源头主要为微生物源CH4。微生物源CH4由产甲烷菌产生，可来自自然界和农业，主要包括沼泽地、水稻田和畜牧业(反刍动物)[1]。2016年，胃肠道CH4排放量为9 870万t，乳制品行业是全球胃肠道CH4的主要生产行业，CH4排放量为1 860万t[2]。反刍动物尤其是奶牛将是研究重点，反刍动物CH4的排放除了标志着饲粮能量的损耗，也将加剧全球气候变暖。在维持反刍动物健康及其瘤胃正常发酵功能的前提下，降低动物机体CH4排放量，既有利于提高饲粮能量利用，又有助于缓解全球气候变暖。因此，越来越多的学者关注于反刍动物CH4排放。

反刍动物CH4排放量的检测方法具有多种，适用范围不同。检测方法的选用是研究的基础，关于反刍动物CH4排放量检测方法中的直接检测方法已有报道[3]，本文将对间接测定方法进行论述。

1 间接测定法

检测方法可分为直接法和间接法。直接法主要包括呼吸代谢室法、SF6示踪法和GreenFeed系统法。直接法具有测量准确的优点，呼吸代谢室法更是被作为“黄金标准”。但直接测定法也具有弊端，如造价高、操作复杂等。间接法具有成本低、操作简单、短时间内可重复测量和适用范围广的优点，因此间接法也是一种选择，其主要分为二氧化碳(CO2)示踪法、嗅探器法和激光检测器法等。

1.1 CO2示踪法

Madsen等[4]提出了用估算的CO2排放量和测量的呼出气体中CH4∶CO2的比值来测算动物CH4排放速率的方法。CO2的排放量可以基于能量代谢、产热和呼吸熵或碳平衡来估算，呼出气体中CH4∶CO2的比值可通过便携式设备测量。计算公式为：

CH4(g/d)=CO2×([CH4]M-[CH4]BG/
([CO2]M-[CO2]BG)。

式中：CO2是估算的动物生产量(g/d)；[CH4]M和[CO2]M分别为测定的呼出气体样品中CH4和CO2的浓度；[CH4]BG和[CO2]BG是背景空气浓度。

表1 反刍动物CH4排放量的间接测定方法及其应用特点Table 1 Indirect methods of CH4 emission from ruminants and its application characteristics

CH4∶CO2比值对结果至关重要，CH4和CO2的排放量与干物质采食量(DMI)密切相关。另外，动物CO2的排放量即使在DMI相同的情况下，也会受到消化和代谢活动变化以及饲料利用率差异和瘤胃发酵变化的影响[5]。因此，CO2示踪法与GreenFeed法相同，应当有足够的采样次数和时间点。样品气体的来源(呼出气体、直肠排气、粪便或卧床垫料的发酵等)以及由于动物活动、饲粮颗粒大小、饲喂频率相关的发酵速率的差异而导致的CH4∶CO2比值的日变化，都会影响此方法的准确性[4]。

CH4∶CO2比值的应用在某些方面与SF6示踪法相似，但与SF6示踪法相比，其示踪气体(CO2)的排放量为估算值，而SF6示踪法采用瘤胃内渗透管中的示踪气体(SF6)的释放率为已知并经校准。另外，此方法估算的CO2产量只能代表某个时间点，并不是全天综合测量。Haque等[6]分别用此方法估算和用呼吸室法测量的CO2产量计算CH4产量，结果表明，与呼吸室法相比，此方法的CH4产量的组间差异较小并改变了组间的显著差异性。Hellwing等[7]将此方法与呼吸室法相比，此方法显著低估了CH4的排放量(降低了17%)。需要改进对动物因素引起的CO2排放量的日变化的预测，以获得更加准确的个体动物CH4排放量估算值。虽然CO2示踪法不及“黄金标准”的呼吸代谢室法准确，但其操作简单也不受场地限制，具有更强的灵活性。

1.2 嗅探器法

Garnsworthy等[8]提出了另一种间接法—嗅探器法，通过估算动物的嗳气频率和嗳气中的CH4含量，进而算出CH4排放量。在自动挤奶系统的喂料槽中安装取样口，每隔1 s对料槽空气中的气体浓度进行连续取样、分析和记录。程序识别和量化CH4浓度峰值(嗳气)和峰值频率(嗳气频率)，计算每只动物每次挤奶时的CH4排放速率(MER)，即每分钟嗳气次数乘以嗳气峰面积。使用经校准的气体释放量，在每个采样周期结束时估算嗳气稀释率。计算公式如下：

CH4(mg/L)=(嗳气峰面积×嗳气频率)×
稀释因子[9]。

对于测量呼出气体中气体浓度的嗅探器技术，动物头部距采样点的距离对CH4和CO2浓度的影响巨大。即使是头部位置的微小变化也会在测量的气体浓度上产生很大的差异，CH4浓度的变化与头部移动和位置的差异以及喂料槽几何形状产生的可变空气混合状态相关联，而不是CH4排放量[5]。Wu等[10]还提出了牛只呼气速率之间的差异也可导致系统误差。呼出气体中CH4浓度的重复性与每次挤奶过程中头部位置和行为的重复性具有简单的关联性。比如测得牛只的CH4排放量较低，其实质原因可能是牛只在挤奶过程中不安宁或者习惯将头部远离采样管。另外需要关注的是，单个牛只在每次挤奶时由于产奶量、胎次、同时挤奶的奶牛数量和社会优势等因素造成的行为差异，采食量和饲喂方式的差异[11]，以及采样时间的差异，将影响结果的重复性和准确性。牛只呼出气体中的CH4相对于CH4总产生量的比例，在动物之间有一定的变化范围，这也将对试验结果造成影响。

有研究表明，同一动物在牧场挤奶期间的MER与在呼吸室内测得的每日总CH4排放量之间存在正相关关系[8]。但Huhtanen等[5]发现，在2项奶牛试验中其可变性均较大，并且与GreenFeed法的结果没有相关性。Van Engelen等[12]在自动挤奶系统中使用嗅探器法测出空气中CH4∶CO2的比例平均值和变异系数分别比Aubry等[13]的结果高出约2倍和5倍，在生物学上都是不现实的，其原因有待进一步探究。该方法遗漏了呼气中的CH4排放量；另外，奶牛间CH4排放量的真实变化太小，嗅探器方法精度较低，所以需要进一步改进以得到可靠的测量值。但是嗅探器法在长时间条件下，只需较少的费用就可进行数百次的重复测量。

1.3 激光检测器法

激光CH4检测器基于CH4的红外吸收光谱原理，在距动物1～3 m内，可以测量出装置与动物间的空气中的CH4浓度。数据采集程序为连续2～4 min的短时间测量，结果由一系列代表动物呼吸周期的峰值组成。仅使用由于呼气或嗳气导致CH4浓度增加的峰值进行分析，测量的气体浓度根据采样距离和背景浓度进行调整[14]。

激光检测器法没有采集气体样品，而是对动物呼吸的实时测定。结果为由于呼吸的生物力学和测量装置的正常波动而产生的自然波动，波动除了正常的呼吸周期外，还包括阵发性的反刍片段以及微小的波峰和波谷。呼吸周期从最大峰值中获得，微小的波峰和波谷不会影响测量结果，完整呼吸周期内的波动可以用滚动平均法或数据平滑方法来调整[15]。虽然激光检测器法可以很容易地获得CH4浓度的平均值，但为了改进激光检测器法数据与呼吸室数据之间的相关性，并提高检测单个动物之间CH4排放差异的技术灵敏度，需要将收集的数据分为呼气和嗳气CH4[16]。可用每个测定周期的标准差作为阈值，从而将反刍片段从呼吸周期中分离。风向会影响测量结果，导致测量值由大到小的风向分别为顺风、侧风和逆风，并且风速与测量值呈显著逆相关。

激光检测器法与呼吸代谢室法之间只存在较弱的正相关关系[14,17]。其准确性受温度、风速、湿度和邻近动物等因素的影响，并且研究人员需要频繁地接触动物也将带来差异。但是该方法不受头部位置影响且测量速度快，可以在饲养场和大群试验动物条件下应用，只要动物保持足够时间的静止，在挤奶和采食等情况下均可测量。

2 间接预测CH4指标

2.1 DMI

在全球网络数据库中显示，CH4预测模型中的变量越多，其结果越准确。然而，仅含DMI的简单预测模型与较复杂模型相比，预测能力无差异[均方根百分比误差(RMSPE)=15.2%～21.4%][1]。因此，仅仅需要DMI就足以预测胃肠道CH4排放清单[18]。

Appuhamy等[19]使用包含实测的DMI和饲料特征属性的数据评估了40个预测方程。然后再使用估测的DMI重新评估每个区域(北美、欧洲、澳大利亚和新西兰)中表现最好的模型，并与使用实测DMI得到的预测值进行比较。对于北美地区，DMI估测值可以一样能够很好地预测CH4排放量；对于欧洲，使用DMI估测值比DMI测量值能够更好地预测CH4排放量；而对于澳大利亚和新西兰，DMI估测值预测CH4排放量的效果不佳。可能因为预测模型是根据北美地区数据得到的，无法适用于澳大利亚和新西兰采食牧草较多的放牧牛只。结果表明，只要能够合理准确地估测出DMI，将其带入模型得出的CH4排放量与实测数据一样准确。

但是CH4排放量实测值与DMI之间的决定系数是高度可变的，受DMI数据值范围和CH4排放量检测方法等因素的影响。DMI数据值范围方面，Charmley等[20]选择来自澳大利亚的肉牛及奶牛共1 033个测量数值作为数据集，研究表明CH4排放量和DMI之间具有较强的相关性。当DMI数据值范围为2～28 kg/d时，截距接近于0；当DMI数据值范围缩小为>15 kg/d时，CH4排放量和DMI之间决定系数(R2)降低至0.41，RMSPE增加至68.2。DMI数据值范围越广，它们之间的关系越强[20-21]；DMI数据值范围越窄，关系越弱[22]。CH4排放量检测方法也会影响R2，Grainger等[23]对奶牛数据进行了Meta分析，采用SF6技术测量的CH4排放量和DMI之间的R2=0.56，而采用呼吸测热室测量的CH4排放量和DMI之间的R2=0.39。在Hristov等[22]的奶牛试验中表明，GreenFeed系统与SF6技术之间具有差异，得到的CH4排放量和DMI之间的R2分别为0.47和0.08。Niu等[24]年发现，与呼吸测热室相比，采用GreenFeed系统与SF6技术得到的CH4排放量和DMI之间的相关性较弱。

2.2 CH4排放因子

目前，一些国家通常使用IPCC Tier 2方程来评估动物胃肠道CH4排放量：

CH4=Ym×GEI。

式中：CH4是胃肠道CH4排放量，单位为MJ/(头·d)；Ym为CH4转换因子，定义为GEI的百分比。

虽然GE可以用氧弹法测定，但这种分析方法繁琐。IPCC(1997)指南通过确定机体维持净能来估算GEI，然后使用估算的能量消化率和可消化能量利用效率将其与DMI联系起来。确定GEI和Ym所涉及的步骤在估算胃肠道CH4排放量时会引起误差。将Ym作为恒定值是主要原因，因为它随着DMI和DM消化率的变化而发生较大变化[20]，它可以是3%～10%的任意值[25]。饲粮质量、生产水平(与DMI相关)和饲粮结构等因素均影响以CH4形式造成的能量损失比例[26-27]。因此，设定一个常数Ym可能会导致CH4排放量估算中相当大的不确定性，特别是在具有不同生产系统的地区。如北美奶牛的平均Ym为5.4%～5.7%，欧洲Ym为6.0%～6.9%，澳大利亚和新西兰该值(6.6%)更接近IPCC建议值[1]。近年来国内已有相关研究，王贝等[28-29]试验表明，泌乳中期荷斯坦奶牛的Ym高于泌乳高峰期荷斯坦奶牛；董利锋等[30]和李斌昌等[31]研究表明，饲粮结构显著影响荷斯坦泌乳后备牛的Ym。

因此，应该在各个区域而不是全球的基础上建立估算奶牛胃肠道CH4排放量的模型。

2.3 血液胰岛素及乳中脂肪酸浓度

反刍动物CH4排放量和血液代谢产物均受到饲粮类型和DMI的影响，所以CH4排放量和血液代谢产物之间可能存在某些相关性。在奶牛试验中表明，甲烷产量高组牛只与甲烷产量低组相比，其具有较高的血液胰岛素浓度和较低的葡萄糖/胰岛素比值[2]。在随后的相关性分析中显示，牛只CH4产量与血液胰岛素浓度和葡萄糖/胰岛素比值均具有中等强度的相关性，R2分别为0.54和0.52。研究证明，血液胰岛素浓度具有作为奶牛CH4排放量标志物的潜力，具体关系还有待进一步探究。

瘤胃中的发酵还导致产生VFA，VFA是乳腺中合成短链和中链脂肪酸的前体物质。此外，某些VFA(如乙酸或丁酸)产生途径会导致氢气(H2)的产生，而丙酸产生途径会使用H2，产甲烷菌也会利用H2产生CH4。因此，瘤胃发酵和CH4生成与牛奶脂肪酸成分之间存在直接的相互作用。Van Lingen等[32]采用Meta分析法得出牛奶脂肪酸成分与瘤胃CH4排放量之间呈中等强度关系；Bougouin等[33]也使用Meta分析法，共搜集了来自5个国家825头荷斯坦泌乳牛的数据，结果表明牛奶中脂肪酸可以较好地预测CH4产量。

3 预测模型

测定反刍动物CH4排放量，需要花费大量的人力和物力，在生产实践中也无法对所有动物进行测定，可通过CH4预测模型解决。预测模型是根据反刍动物CH4排放量的实测数据，应用统计方法建立的统计模型。总的来说，胃肠道CH4预测模型是基于各种动物或饲料的特征，但以某种形式受DMI支配[1]。因此，准确预测DMI是准确预测反刍动物CH4排放的关键。预测模型已被广泛应用于各种用途的CH4排放量估测，比如预测CH4排放清单，模型类型包括从简单的排放因子和经验模型到更详细的机理模型。

3.1 经验模型

经验模型是根据大量的测量数据结合能量平衡的原理，建立在饲粮摄入量、饲粮成分和其他动物因素与胃肠道CH4排放之间的数学或统计关联基础上的。自Kris等[34]建立统计模型以来，已经发展出多个经验模型。经验模型可以相对容易地从观测数据中建立，并不需要输入大量数据，所以常被用来估算全国或全球动物胃肠道CH4排放量清单，以评估CH4对温室气体的作用。

Demarchi等[35]和颜志成等[36]分别在肉牛和奶牛上进行了研究，用不同季节的DMI和CH4排放量建立了CH4预测模型，结果表明春季模型的R2均高于冬季。Demarchi等[35]模型：

春季CH4(g/d)=36.31×dDMI(kg/d)-
3.9(R2=0.92)；
冬季CH4(g/d)=18.11×dDMI(kg/d)+
53.64(R2=0.53)。

式中：dDMI为可消化的干物质采食量。

颜志成等[36]模型：

CH4(g/d)=22.4×DMI(kg/d)+26.4(R2=0.90)；
CH4(g/d)=17.0×DMI(kg/d)+11.1(R2=0.30)。

使用DMI作为单一变量，忽略了饲粮的特性对动物CH4排放量的影响。因此，Moe等[37]使用摄入饲粮的中性洗涤可溶物、纤维素和半纤维素含量与奶牛CH4排放量，摄入饲粮的瘤胃可消化的中性洗涤可溶物、纤维素和半纤维素含量与奶牛CH4排放量分别建立了预测模型。Moe等[37]模型：CH4(g/d)=61.7+9.25×NDS(kg/d)+48.0×Cel(kg/d)+31.5×Hemi(kg/d) (R2=0.67)；CH4(g/d)=33.3+20.7×dNDS(kg/d)+106×dCel(kg/d)+38.8×dHemi(kg/d)(R2=0.73)。

式中：NDS为中性洗涤可溶物；Cel为纤维素；Hemi为半纤维素；dNDS为瘤胃可消化的中性洗涤可溶物；dCel为瘤胃可消化的纤维素；dHemi为瘤胃可消化的半纤维素。

此后，冯仰廉[38]使用肉牛CH4排放量、粗饲料来源中性洗涤纤维和瘤胃可发酵有机物质建立了预测模型，进一步提高了R2(0.97)。冯仰廉[38]模型：

CH4(L)=0.297×FNDF(kg)+60.46×
FOM(kg)(R2=0.97)。

式中：FNDF为瘤胃可发酵中性洗涤纤维；FOM为瘤胃可发酵有机物。

在肉用绵羊上，周艳等[39]进行了全面研究，对不同生长阶段分别建立了一元和多元方程。生长早期分别为：

CH4(L/d)=-26.58×NFC/NDF+92.7
(R2=0.772)；
CH4(L/d)=2.71×DNDF-2.45×
DDM-0.97×DCP+124.46(R2=0.846)。

生长后期分别为：

CH4(L/d)=-57.00×GE(MJ/kg)+
1 076.0(R2=0.581)；
CH4/BW0.75(L/kg0.75)=-0.013×
NDFI(g/d)-0.13×CPI(g/d)+0.02×DMI(g/d)+
0.84(R2=0.652)。

生长期整体为：

CH4(L/d)=-26.94×NFC/NDF+90.71
(R2=0.655)；
CH4/BW0.75(L/kg0.75)=0.005×
DNDFI(g/d)+0.011×dDMI(g/d)-0.097×
DCPI(g/d)-4.78 (R2=0.722)。

理想的经验模型，应该从包括1 000个以上动物或处理组平均测量值中建立，并有影响动物CH4排放量的饲粮和动物信息。目前，CH4排放数据主要来自欧洲、北美、澳大利亚和新西兰，全球数据来源并不均匀。

3.2 机理模型

与经验模型相比，根据营养代谢建立的机理模型数量有限，其通过预测动物消化道的营养物质吸收以及VFA产量，并且通过增加氢的计算来改善对胃肠道CH4排放量的预测。

机理模型预测CH4排放量的基本原理相似。均建立了瘤胃或后肠发酵过程中营养物质的消化、吸收、微生物生长和发酵的化学计量法，以确定VFA的类型和数量、产氢量以及最终的胃肠道CH4排放量。这些模型的主要区别在于所含微生物的数量、饲料的来源和颗粒度、生产VFA的底物以及VFA化学计量法。

在所有的模型中，CH4的排放量都是通过计算瘤胃中的氢平衡得出，并假设所有的氢都转化为CH4。然而，由于饲粮成分的不同将造成动物产氢量较大的差异，并且产氢量具有全天变化，在采食后不久即达到峰值。王荣等[40]的研究对此进行了改进，根据VFA代谢产生的80%的氢用于CH4合成建立的模型与所有的氢用于CH4合成建立的模型相比，大大提高了预测精度。机理模型中CH4排放量的预测精度在很大程度上取决于所用化学计量模型的准确性及其预测VFA摩尔比例的准确性。Alemu等[41]评估了几个化学计量模型，得出RMSPE为5.2%～43.2%，表明它们的性能差异较大。很少有人研究测量VFA的产生率，因为这需要使用同位素来区分在瘤胃中观测到的VFA浓度和生产速率。研究人员使用机械模型Tier 3应用于全国奶牛CH4排放清单，使用这种方法，能够解释由于饲草青贮质量和DMI的变化而观察到的胃肠道CH4排放量的部分变化[42]。

机理模型能够获得更加准确的估算值，但其需要应用与生物化学相关的数学参数，对数据要求较高制约了它的广泛使用。

4 结 论

间接法的测定仪器和预测模型均具有简单快速的优点，可根据各个地区硬件条件和可获得数据，选择合适的测定仪器和预测模型。任何一个特定的模型在预测CH4排放量上都有优缺点，多模型集成方法学已成为一种广泛可接受的方法，可利用互补的单个模型并调整各种偏差来改善预测准确度。适用性广且稳定性高的预测模型必须基于大数据的采集与分析，从众多的因果参数中归纳他们之间的关联，目前我国数据量仍然不足，加大动物的测定数量，建立适用于当地的预测模型是非常必要的。