环状RNA Circ-RANBP1在胰腺癌组织中的表达及其对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

李思思 宋佳鸿 何亚迎 黄 英

民航上海医院消化内科(200336)

背景：大量研究表明，环状RNA(circRNA)异常表达与多种肿瘤的发生、发展、预后等密切相关，是理想的诊断指标和治疗靶点。但circRNA在胰腺癌发生、发展中的作用尚需进一步探究。目的：探讨circ-RANBP1在胰腺癌组织中的表达及其对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法：以原位杂交法检测circ-RANBP1在胰腺癌组织和相应癌旁正常组织中的表达。常规培养MIA PaCa-2细胞和SW 1990细胞，分别转染circ-RANBP1敲低寡聚物和过表达质粒，并设立相应对照组。qRT-PCR法检测circ-RANBP1在胰腺癌细胞中的表达。EdU实验检测circ-RANBP1对细胞增殖能力的影响。Transwell实验检测circ-RANBP1对细胞迁移、侵袭能力的影响。蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测circ-RANBP1对细胞上皮-间质转化(EMT)进程的影响。血管形成实验评估circ-RANBP1表达对血管形成能力的影响。结果：Circ-RANBP1在胰腺癌组织中表达增高，且与患者的不良预后密切相关。Circ-RANBP1下调能抑制MIA PaCa-2细胞增殖，而circ-RANBP1过表达可促进SW 1990细胞增殖。与对照组相比，敲低circ-RANBP1能抑制MIA PaCa-2细胞迁移和侵袭，而过表达circ-RANBP1可促进SW 1990细胞迁移和侵袭。敲低circ-RANBP1可抑制EMT，过表达circ-RANBP1可促进EMT。抑制circ-RANBP1表达可明显降低血管形成能力，过表达则可明显促进血管形成。结论：Circ-RANBP1在胰腺癌组织中高表达，并可促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT和血管形成。

胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，预后极差，五年生存率仅为9%[1]。然而，胰腺癌发病隐匿，缺乏有效的早期诊断方法，大多数胰腺癌患者发现即处于疾病晚期，失去手术治疗的机会[2]。因此，寻找胰腺癌早期诊断和有效治疗靶点仍是胰腺癌研究的重点。

环状RNA(circRNA)是由RNA反向剪接形成的一种共价闭合环状非编码RNA，主要由外显子和(或)内含子构成，广泛存在于真核细胞中[3]。与传统线性RNA不同，circRNA缺乏5’端帽结构和3’端Ploy(A)尾结构，因此能够抵抗RNA核酸外切酶的降解，较线性RNA更稳定[4]。同时，circRNA具有高度保守性和组织特异性，具备分子标志物的潜能[5-7]。大量研究表明，circRNA异常表达与多种肿瘤的发生、发展、预后等密切相关[8-11]，是理想的诊断指标和治疗靶点。但circRNA在胰腺癌发生、发展中的作用尚需进一步探究。本研究通过分析胰腺癌的circRNA GSE数据集(GSE69362、GSE79634)，筛选出在胰腺癌中高表达的hsa_circ_0092314(circ-RANBP1)，旨在探讨其在胰腺癌组织中的表达及其对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭等细胞生物学过程的影响。

材料与方法

一、细胞株、组织芯片和主要试剂

人胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、HPDE6-C7、MIA PaCa-2、SW 1990、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购于中国科学院细胞库；胰腺癌组织芯片(TMA，含有30例胰腺癌组织和对应癌旁正常组织)购于上海芯超生物科技有限公司；DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清、青链霉素均购自美国Gibco公司；circ-RANBP1过表达质粒(circ)、circ-RANBP1敲低寡聚物(si-circ)均由广州吉赛生物科技有限公司合成；EdU试剂盒购于广州锐博生物技术有限公司；脂质体Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；Trizol裂解液、逆转录和实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；蛋白酶K、RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司。基质胶购自美国BD公司。E-cadherin、N-cadherin一抗均购自Cell Signaling Technology, Inc.。

二、方法

1.原位杂交(ISH)染色：Circ-RANBP1探针由广州吉赛生物科技有限公司合成。根据实验步骤对组织芯片进行染色，ISH染色镜检结果由两位经验丰富的病理科专家进行判定，并依据染色强度和染色范围进行评分。染色强度：0分，无染色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色；染色范围：0分，0%～10%；1分，11%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。总评分为染色强度与染色范围之积，≤4分为circ-RANBP1低表达，>4分表示circ-RANBP1高表达。

2.细胞培养：MIA PaCa-2细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，SW 1990细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，培养条件均为37 ℃、5% CO2。细胞生长至融合度为80%～90%时进行消化传代。

3.细胞转染：将MIA PaCa-2和SW 1990细胞分别接种于6孔板，当细胞融合度为60%～70%时，应用Lipofectamine 3000对MIA PaCa-2细胞转染circ-RANBP1敲低寡聚物及其对照物，对SW 1990细胞转染circ-RANBP1过表达质粒和空载质粒，组别依次命名为si-circ组、si-NC组、circ组、vector组。转染6 h后换液继续培养，转染24 h后，用qRT-PCR验证转染效率。实验重复3次。

4.qRT-PCR法：加入Trizol试剂提取细胞内总RNA，反转录为cDNA，行实时荧光定量PCR。circ-RANBP1引物上游：5’-GCT GAT CTC TTC CCT GCT CA-3’，下游：5’-AGG CTC CGC AAC AAC TAA TG-3’；内参GAPDH引物上游：5’-GGG AAG GTG AAG GTC GGA GT-3’， 下游：5’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC A-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。实验重复3次。

5.EdU实验：细胞转染48 h后，收集并将细胞接种于96孔板中，按照说明书步骤对细胞进行EdU标记、Apollo染色、DNA染色、图像采集和分析。实验重复3次。

6.Transwell实验：细胞转染48 h后，收集细胞并用无血清培养基重悬细胞，接种于Transwell上室中，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，常规培养16 h。轻轻擦去上室内的细胞，多聚甲醛固定，用0.1%结晶紫染色，随后显微镜下拍照并采集图像，随机取5个视野统计迁移细胞数，取均值。实验重复3次。

细胞侵袭实验是在小室滤膜上包被基质胶，其余步骤同上述细胞迁移实验，显微镜下随机取5个视野统计细胞数，取均值。实验重复3次。

7.蛋白质印迹法：取对数生长期的细胞，消化后接种于6孔板中，细胞转染48 h后加入RIPA裂解液，提取各组细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，E-cadherin、N-cadherin一抗工作浓度均为1∶1 000。以GAPDH作为内参，ECL法显影并保存图像。实验重复3次。

8.免疫荧光染色：采用4%的多聚甲醛溶液将已爬好细胞的玻片进行固定，5%的BSA封闭1 h后加入一抗(E-cadherin、N-cadherin一抗工作浓度均为1∶100)，4 ℃孵育过夜。PBS漂洗后加入荧光二抗，室温孵育1 h，PBS漂洗后加入DAPI染色液，显微镜下拍照并采集图像。实验重复3次。

9.血管形成实验：将转染48 h的HUVEC接种6孔板中，待贴壁后，PBS洗涤，换无血清培养基培养24 h，收集上清液；提前将基质胶铺到预冷的96孔板中，每孔60 μL，37 ℃凝固30 min。将HUVEC消化离心后用预先收集的上清液重悬为 3×104/100 μL，每孔100 μL加入备用的96孔板，细胞培养箱常规培养6 h。显微镜下随机取5个视野计数血管内皮细胞成管数量。实验重复3次。

三、统计学分析

结 果

一、Circ-RANBP1在胰腺癌组织中的表达及其与胰腺癌患者临床病理特征之间的关系

与癌旁正常组织相比，circ-RANBP1在胰腺癌组织中的表达显著升高(6.97±0.58对3.70±0.49)，差异有统计学意义(t=4.321，P<0.05；图1A-1B)。根据circ-RANBP1在胰腺癌组织中的表达，将胰腺癌患者分为高表达组和低表达组，结果显示circ-RANBP1表达与胰腺癌患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、N分期、神经侵犯、血管侵犯等无关(P>0.05)，而与患者的T分期、M分期、AJCC分期密切相关(P<0.05；表1)。Kaplan-Meier生存分析显示，高表达circ-RANBP1的胰腺癌患者生存期显著低于低表达者(图1C)。

表1 Circ-RANBP1表达与胰腺癌患者临床病理特征之间的关系(n)

A-B：胰腺癌和相应癌旁正常组织中circ-RANBP1表达(ISH染色)；C：Circ-RANBP1表达与胰腺癌患者生存期的关系(Kaplan-Meier生存分析)

二、Circ-RANBP1在胰腺癌细胞中的表达以及细胞转染效率

与正常胰腺导管上皮细胞相比，circ-RANBP1在胰腺癌细胞中的表达明显升高(图2A)。筛选出circ-RANBP1表达相对较高的MIA PaCa-2细胞转染si-circ-RANBP1，circ-RANBP1表达相对较低的SW 1990细胞转染circ-RANBP1过表达质粒。结果显示，与对照组相比，si-circ-RANBP1可显著降低circ-RANBP1表达(P<0.05)，而转染过表达质粒可明显提高circ-RANBP1表达(P<0.05;图2B)。

A：circ-RANBP1在不同胰腺癌细胞中的表达；B：验证circ-RANBP1的敲低和过表达效率

图3 EdU实验检测circ-RANBP1对胰腺癌细胞增殖能力的影响

三、Circ-RANBP1对胰腺癌细胞增殖能力的影响

EdU实验结果显示，circ-RANBP1敲低后，MIA

四、Circ-RANBP1对胰腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响

Transwell迁移实验结果显示，与对照组相比，circ-RANBP1敲低组MIA PaCa-2细胞迁移数目显著减少，而circ-RANBP1过表达组SW 1990细胞迁移数目明显增多(P<0.05)；Transwell侵袭实验结果显示，circ-RANBP1敲低组MIA PaCa-2细胞侵袭数目明显少于对照组(P<0.05)，circ-RANBP1过表达组SW 1990细胞侵袭数目显著多于对照组(P<0.05；图4)。表明circ-RANBP1可促进细胞的迁移、侵袭能力。

图4 Transwell实验验证circ-RANBP1对胰腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响

五、Circ-RANBP1对细胞上皮-间质转化(EMT)的影响

蛋白质印迹法结果显示，circ-RANBP1敲低能促进上皮标志物E-cadherin表达，抑制间皮标志物N-cadherin表达，而circ-RANBP1过表达能抑制E-cadherin表达，促进N-cadherin表达(图5A)；免疫荧光实验进一步证实了上述实验结果(图5B)。由此可见，circ-RANBP1能影响细胞的EMT。

A：蛋白质印迹法；B：免疫荧光法

六、Circ-RANBP1对血管形成能力的影响

图6 Circ-RANBP1表达对血管形成能力的影响

讨 论

CircRNA是非编码RNA家族重要成员，以往被认为是RNA异常剪切产生的基因副产物，无细胞生物学功能[12-13]。近年，随着高通量测序技术的发展以及研究的深入，发现了越来越多的circRNA，且在细胞的生理和病理过程中发挥重要作用[14-15]。研究显示，多种circRNA在胰腺癌中异常表达，参与调控胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移等细胞生物学行为[16-17]，并可作为胰腺癌的诊断和预后指标[18]。因此，深入研究胰腺癌相关circRNA不仅能够丰富和完善胰腺癌的发病机制，而且可为寻找胰腺癌早期诊断和治疗靶标提供参考。

本研究选取了与胰腺癌相关的circ-RANBP1作为研究对象，旨在探讨其对胰腺癌细胞生物学功能的影响及其作为潜在诊断标志物的潜能。结果显示circ-RANBP1在胰腺癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织。进一步分析显示circ-RANBP1高表达与胰腺癌患者的TNM分期密切相关。Kaplan-Meier生存曲线分析表明，circ-RANBP1高表达与胰腺癌患者的生存期呈负相关。说明circ-RANBP1表达对评估胰腺癌患者的分期以及预后有重要参考价值。

本研究通过qRT-PCR法发现，circ-RANBP1在胰腺癌细胞中的表达明显升高。为进一步验证circ-RANBP1对胰腺癌细胞功能的影响，通过细胞转染的方法上调或下调circ-RANBP1表达。结果显示circ-RANBP1表达降低后，胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力降低；而circ-RANBP1过表达后，细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显升高。进一步提示circ-RANBP1可能是胰腺癌潜在的治疗靶点。

EMT为肿瘤转移过程中的重要步骤，即上皮细胞通过改变其形态、修饰黏附分子，获得迁移和侵袭行为[19-21]。大量研究表明，circRNA可通过调节EMT来影响肿瘤细胞的迁移和侵袭[22-24]。本研究结果显示，下调circ-RANBP1表达可抑制EMT，而上调circ-RANBP1表达可促进EMT。此外，实体肿瘤的增殖需要大量的新生血管为其快速增长提供所需的营养物质和氧供[25]。本研究中，circ-RANBP1能促进血管形成，为其在胰腺癌细胞生物学功能中的作用提供了进一步的证据。

综上所述，本研究证实了circ-RANBP1在胰腺癌组织中高表达，并能调节胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，促进EMT和血管形成，进而发挥促癌作用。本研究结果有望为胰腺癌的诊治提供更广阔的前景。