循环miRs在2型糖尿病中的研究进展

谢 涛，张 婷，范茗华，罗晓婷

（1.赣南医学院2019级硕士研究生；2.赣南医学院2020级硕士研究生；3.赣南医学院2017级临床医学专业本科生；4.赣南医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 赣州 341000）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是全球最普遍的代谢疾病之一，国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）数据显示，至2019年有4.63亿人（占人口的9.3%）患有DM，预计这一数字到2045年将达到7亿（占人口的10.9%），2019年，20～79岁DM患者人数最多的国家是中国、印度和美国，预计到2030年仍将如此［1］。2019年，中国DM患病人数已达1.164亿，预计到2045年将达到1.472亿。近年来，有几种方法一直是诊断DM的黄金标准，包括空腹血糖（Fasting blood glucose，FPG）水平、餐后2小时血糖（2hPG）水平和糖化血红蛋白（Glycosylated hemoglobin，HbA1c）水平。2010年，美国糖尿病协会（American diabetes association，ADA）增加了HbA1c作为DM和DM前期的诊断标准［2］。然而，由于个体差异、检测平台和检测工具的不同，数据存在一定比例的高偏差和低再现性。2型糖尿病是最常见的DM类型，约占全球DM的90%［3］。迄今为止，T2DM的病因仍不清楚，发病率和患病率仍在急剧上升。T2DM在全球的形势非常严峻，如果能够对糖尿病前期（Pre-DM）人群实施预防性干预，改善对这些个体的护理，T2DM的发病和发展将会大大推迟，从而延迟T2DM的发生或降低其严重性［4］。因此，筛选和鉴定对T2DM诊断和预后具有高度特异性和敏感性的新型生物标志物是当前临床研究的重点和未来的挑战［5］。

1 循环miRNA结构、组成与功能

miRNA是由大约22个核苷酸组成的单链核糖核酸，来源于内源性发夹状转录物［6］，能够通过降解或翻译抑制特定目标RNA来抑制基因表达［7-8］。他们在细胞内首先形成长度为70～90个碱基的单链RNA前体（Pre-miRNA）［9］，再经一种称为Dicer酶的RNA酶进行剪切后形成。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成RNA诱导的沉默复合体（RNAinduced silencing complex，RISC）［10］，通 过 与 其 靶mRNA分子3′端非翻译区（3′UTR）互补匹配，再以目前尚不清楚的机制抑制该mRNA分子的翻译［11］。在临床上，一个理想的生物标志物应该通过微创采样能够容易被获得，血液、尿液或唾液检测成为很好的选择来源［12］。在试图鉴定miRNA是T2DM新型生物标志物的过程中，miRNA表达谱通常在培养的细胞、血液和实体组织样品中进行［13］。2008年，LAWRIE等［14］在血液中检测到循环miRNA，血液携带大量的生物分子，包括营养物质、激素等分子，在这些分子中，循环miRNA被认为存在于血液循环中，并且是有用的检测指标，不仅在血细胞中可检测到，在游离状态下还发现了血液循环中部分重要的miRNA［15］。在人血循环中处于游离状态的细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），根据其直径不同，可分为四个亚群，它是外泌体（Exosomes，EXs）、微泡（Microvesicles，MVs）、凋亡小体（Apoptosis bodies，Apo-BDs）和癌小体（Oncosomes）的混合物，含有可被认为是介导细胞间通讯的一类新的信号分子［16-17］，癌小体是最新发现的类别［18］，而EXs是目前研究的热点。随后也证明循环的体液中（尿液、唾液、眼泪和母乳）含有大量的miRNA［19］。此外，循环miRNA非常稳定，其对于不同的温度、pH、储存时间或者反复冻融都有很好的耐受性，这支持了循环miRNA作为理想生物标志物的用途，并且使用实时定量聚合酶链反应（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）相对容易检测［4］。重要的是，越来越多的研究已经发表。目前关于循环miRNA的研究仅限于单个感兴趣的miRNA，本文通过查阅文献尽可能收集相关循环miRNA的研究成果，探讨循环miRNA表达的异常与T2DM的发生、发展的关系。

2 T2DM受试者循环miRNA的特点研究

多数研究表明，miRNA具有T2DM生物标志物的潜能（表1），当采用qPCR和（或）microarray去检测循环miRNA时，发现当miRNA转录为mRNA时受到正向调控，表达上调；当miRNA受到抑制时，表达下调；部分循环miRNA表达无变化，其原因有两方面，其一是反义RNA与miRNA结合后，序列很短，导致Dicer酶不能有效结合；其二是miRNA与Ago2以RISC复合物的形式存在，该复合物也会导致Dicer酶无法有效结合。综上，循环miRNA可能是预测T2DM的诊断工具，这些miRNA可能与T2DM的发病有关，这些miRNA可以在Pre-DM人群作为预测该病发生的工具。

表1 T2DM受试者循环miRNA的特点研究

续表1 T2DM受试者循环miRNA研究的特点

续表1 T2DM受试者循环miRNA研究的特点

3 不同循环miRNA和T2DM相关性研究

3.1 循环miRNA和T2DM相关性的异质性研究JIMÉNEZ-LUCENA R等［2］通过60个月的中位随访调查，观察到各组间血浆miR-9、miR-28-3p、miR-29a、miR-103、miR-126和miR-375的基线血浆水平显著低于非T2DM患者，各组间血浆miR-7和miR-320水平无显著差异。Cox回归分析显示，miR-28-3p、miR-29a和miR-9水平低的患者具有更高的疾病风险（HR=11.27；95%CI=2.61～48.65），模型的AUC为0.834。更重要的是，相关研究结果显示，miRNA水平的改变比T2DM的发展早了3年，因此，模型在这段时间内更具有预测能力。ZAMPETAKI A等［20］、WAN S等［21］调查了T2DM诊断前的miRNA血浆水平，显示miR-9的血浆水平可能被用作预测性生物标志物。发现30个微小核糖核酸在T2DM个体中有差异表达。其中包括miR-126和miR-320减少以及miR-28-3p增加。KONG L等［22］研究结果显示，与T2DM易感个体和健康对照组相比，新诊断的患者血 清 中miR-9、miR-29a、miR-375显 著 上 调（P=0.0030），这意味着它有作为T2DM生物标志物的潜力，这些微小核糖核酸都与胰岛素调节有关。PORDZIK J等［19］研究发现，血清miR-320a和miR-375在T2DM被上调，并且该研究加强了miR-9、miR-29a和miR-375可能在胰岛素调节和T2DM发病中发挥作用的假设。

3.1.1 循环miR-7和T2DM相关性研究WAN S等［21］研究发现T2DM患者血清miR-7显著升高（P＜0.001），循环miR-7主要以游离外泌体形式存在，而不是以膜结合外泌体形式存在，研究充分表明miR-7水平的增加与T2DM的发生和发展有关。此外，与健康对照组相比，在T2DM患者中，血清miR-7水平与血清葡萄糖呈正相关，这表明循环miR-7与β细胞功能障碍和胰岛素分泌受损有关。WAN S等［21］和JIMÉNEZ-LUCENA R等［2］关于miR-7的研究结果有差异，这可能和选用的样品（血清和血浆）和调查方法（病例对照研究和队列研究）有关。需要进一步的研究去验证miR-7是上调还是下调。

3.1.2 循环miR-9和T2DM相关性研究KONG L等[22]研究发现，与T2DM易感个体和健康对照组相比，新诊断的T2DM患者血清中miR-9显著上调。PORDZIK J等[19]研究加强了miR-9可能在胰岛素调节和T2DM发病中发挥作用的假设。JIMÉNEZ-LUCENA R等[2]通过60个月的中位随访观察发现，在T2DM患者中，miR-9的基线血浆水平显著低于非T2DM个体，研究显示miR-9下调，并且血浆miR-9水平较低的患者发生T2DM的风险较高，研究首次证明了血浆中miR-9的水平也是可以区分T2DM患者和非T2DM个体强有力的预测性生物标志物。其中JIMÉNEZ-LUCENA R等[2]和KONG L等[22]关于miR-9的研究出现了差异表达，这可能与选用的样品（血浆和血清）和调查方法（队列研究和病例对照研究）有关，需要进一步的研究去验证miR-9是上调还是下调。

3.1.3 循环miR-28-3p和T2DM相关性研究CHIEN H Y等［12］、PORDZIK J等［19］和ZAMPETAKI A等［20］报道了与非T2DM个体相比，T2DM患者血浆中的miR-28-3p上调。DE CANDIA P等［23］研究显示，与正常糖代谢（Normal glucose metabolism，NGT）受试者相比，糖耐量受损（Impaired glucose tolerance，IGT）患者的血浆miR-28-3p下调。和JIMENEZ-LUCENA R等［2］关于miR-28-3p的研究出现了差异表达，这可能与检测方法（qRT-PCR与microarray和qRT-PCR）有关，需要进一步的研究去验证miR-28-3p是上调还是下调。

3.1.4 循环miR-29a和T2DM相关性研究LIANG Y-Z等［24］研究发现miR-29a的表达水平在T2DM患者和健康对照组之间有显著差异。在一项队列研究中，新诊断的T2DM患者血清中的miR-29a与T2DM易感且NGT受试者相比显著增加，这意味着它们具有作为T2DM生物标志物的潜力。KONG L等［22］研究发现，与NGT受试者相比，新诊断的患者血清中miR-29a显著上调，miR-29a与胰岛素调节有关。miR-29a是T2DM、空腹血糖升高（Impaired fasting glucose，IFG）甚至胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）重要的独立预测因子。根据最近对血清和血浆的两项研究发现，在观察2年的随访样本中，miR-29a与T2DM显著相关［25］。其中JIMENEZ-LUCENA R等［2］和KONG L等［22］关于miR-29a的研究出现了差异表达，可能与选用的样品（血浆和血清）和调查方法（队列研究和病例对照研究）有关，需要进一步的研究去验证miR-29是上调还是下调。

3.1.5 循环miR-320和T2DM相关性研究KAROLINA D S等［25］对健康对照者和T2DM患者血清miRNA的表达谱进行研究发现，与健康对照者相比，T2DM患者外泌体中的miR-320a水平上调。miR-320a和T2DM患者之间可能存在联系，在T2DM患者的血清中miR-320a的表达量均显著高于对照组，这两种情况下miR-320a均存在失调。此外，miR-320a的表达与空腹血糖水平呈强正相关，从而突出了它在Pre-DM患者中的关键作用。YAN S等［26］通 过qRT-PCR和microarray鉴 定出NGT受 试者、Pre-DM人群和新诊断的T2DM患者miR-320b表达有显著差异。通过比较从NGT受试者、Pre-DM人群和T2DM患者获得的microarray数据，与NGT受试者相比，人血清蛋白中的miR-320b在Pre-DM人群和T2DM患者中下调，相关的数据也证明了利用血浆miRNA来区分NGT受试者、Pre-DM人群和T2DM患者的可行性。和JIMÉNEZ-LUCENA R等［2］关于miR-320的研究出现了差异表达，这可能与检测方法（qRT-PCR和microarray）有关，需要进一步的研究去验证miR-320是上调还是下调。

3.1.6 循环miR-375和T2DM相关性研究KAROLINA D S等［25］研究发现，与健康对照组相比，T2DM患者外泌体中的miR-375水平上调。相关研究显示［39-41］，miR-375的水平相对稳定，与健康对照组相比，在T2DM中，血清miR-375几乎没有变化［41］。这很可能是由胰岛中miR-375的高丰度和稳定性以及广泛靶网络有关。SEYHAN A A等［27］研究显示，当校正了年龄、性别和体重指数的混杂影响后，血浆中miR-375的表达在健康对照组和Pre-DM人群和T2DM患者之间没有差异。因此，必须有额外的解释为什么循环的miR-375水平在T2DM患者中没有改变。HIGUCHI C等［11］测量了T2DM患者和NGT受试者的miRNA的血清水平。与NGT受试者相比，循环中的miR-375水平在T2DM患者中增加，并且可能是T2DM新型的生物标志物。JIMÉNEZ-LUCENA R等［2］通过60个月的中位随访调查显示，血浆miR-375在T2DM发病前就已被解除相关，应作为新的生物标志物进一步探索。关于miR-375的研究出现了差异表达，这可能与选用的样品（血浆、血清、外泌体）有关，需要进一步的研究去验证miR-375是上调还是下调。

综上，不同学者研究结果显示，循环miR-7、循环miR-28-3p、循 环miR-29、循 环miR-320和 循 环miR-375失调的方向是不一致的，结果不一致可能与不同实验中不同的纳入/排除标准、样本量、选用样品、调查方法和实验方法有关，从而导致不同发表结果之间难以解释和比较。如果找到合适的研究方法，尽可能控制混杂因素对实验的影响，再去鉴定其功能，对T2DM的研究仍然有重要的意义。

3.2 循环miRNA和T2DM相关性的同质性研究

3.2.1 循环miR-103和T2DM相关性研究LUO M等［5］在研究中使用个体血清和血浆，在区分健康对照个体与Pre-DM和T2DM受试者时，其AUC分别为0.901和0.998；而区分Pre-DM受试者和T2DM患者时，其AUC为0.890。结果表明血清和血浆中循环miR-103a水平显著升高。在区分健康对照个体与Pre-DM和T2DM受试者时，其AUC分别为0.999和0.964；而区分Pre-DM受试者和T2DM患者时我们还检测到血浆中miR-103b水平显著降低，其AUC为0.474，结果表明血清和血浆中循环miR-103b水平显著降低，证明了循环miR-103a和循环miR-103b的相互变化不仅为区分T2DM患者和Pre-DM人群提供了高灵敏度和特异性，而且表示循环miR-103a和miR-103b可作为T2DM诊断的新型生物标志物，具有较高的诊断价值。在研究中，学者们还证明了使用循环miR-103a和miR-103b来区分健康对照者、Pre-DM人群和T2DM患者的可行性。数据表明，循环miR-103家族在诊断性能方面优于其他已被鉴定为T2DM生物标志物的miRNA，总的来说，目前的工作表明miR-103a和miR-103b可以在血清和血浆中有效地测量。

3.2.2 循环miR-122和T2DM相关性研究WILLEIT P等［28］成功量化了826名受试者中810名的循环miR-122水平。血清和血浆中MiR-122水平高度相关（r=0.86；95%CI：0.84～0.88）。研究首次表明，在血清和血浆中测量的循环miR-122的基线水平与T2DM高度相关，循环miR-122水平升高。DE CANDIAP等［23］研究发现，miRNA浓度可能会随着葡萄糖耐量受损而升高，葡萄糖耐量受损与血浆miRNA的整体增加有关，与T2DM患者相比，miR-122水平升高。与NGT受试者相比，差异表达的miR-122-5p在IGT倾向于升高。在一项对T2DM患者的研究中，miR-122的血清水平显著升高［24］。

3.2.3 循环miR-126和T2DM相关性研究ZHANG T等［29］和KATAYAMA M等［30］研究 发 现，在T2DM易感个体和T2DM患者的血浆样品中，miR-126的水平显著下调（P＜0.01），ZHANG T等［29］还揭示了血浆miR-126水平的下调与T2DM发展的风险相关。值得注意的是，ZHANG T等［4］和ZAMPETAKI A等［20］研究表明，miR-126是唯一一种在易感个体和T2DM患者中表达显著低于正常个体的miRNA。ZHANG T等［4］研究显示，miR-126是内皮凋亡小体中最丰富的miRNA，内皮凋亡小体中miR-126的含量以葡萄糖依赖的方式减少，因为凋亡小体和微泡可以转移到其他细胞，低血浆水平可能导致miR-126向单核细胞的传递减少，并导致血管内皮生长因子抵抗和内皮功能障碍。AL-KAFAJI G等［31］揭示了血清miR-126是用于筛查Pre-DM人群和T2DM患者新型的生物标志物，SEYHAN A A等［27］研究也显示，Pre-DM人群miR-126水平显著降低。GIANNELLA A等［32］观察到血浆miR-126-3p的表达从Pre-DM人群到T2DM患者逐渐降低，此外，研究首次发现血浆中miR-126-3p含量与空腹血糖水平呈负相关，表明该生物标志物具有严格的血糖敏感性。OLIVIERI F等［33］研究发现，与健康对照者相比，在T2DM患者中观察到血浆miR-126-5p水平降低。检验miR-126表达的减少是否能预测易感个体T2DM的发作，学者们的结果支持了循环中的miR-126可以发展成一种非侵入性的快速诊断工具，用于预测易感T2DM的个体，结果表明，与健康对照组相比，血浆miR-126是仅在易感个体和T2DM患者中显著降低表达。综上，OLIVIERI F等［33］的观点有待完善，与健康对照组相比，循环miR-126在Pre-DM人群也出现水平下调。miR-126和T2DM之间有显著相关性。重要的是，在T2DM出现之前，miR-126已经改变，提示miR-126是T2DM发病的预测因子［4］。WITKOWSKI M等［34］研究的数据加强了miR-126在T2DM发生、发展中的作用。相关学者还发现，miR-126是与T2DM最相关的miRNA也是对相关循环miRNA进一步研究的重点［21，29，35-36］。

3.2.4 循环miR-192和T2DM相关性研究多项研究［19，25，42］分析了IGT和T2DM患者的miR-192，发现T2DM患者中miR-192有所表达，与健康对照者相比，T2DM患者外泌体中的miR-192水平上调。JAEGER A等［43］的一项研究中，与健康对照组相比，T2DM患者的血清miR-192水平显著升高，鉴定并验证了血清miR-192水平的升高是T2DM潜在的生物标志物。综上研究，miR-192均显示为上调，应作为下一步研究的重点。

综上，不同学者研究表明，循环miR-103、循环miR-122、循环miR-126和循环miR-192失调的方向是一致的，其可能成为T2DM潜在的循环生物标志物，应作为下一步研究的重点。

4 展望

在这篇综述中，我们描述了目前用于检测和研究微小核糖核酸的方法，并总结了迄今为止循环miRNA在T2DM中的研究。循环miRNA作为基因调控的重要开关，能参与几乎所有生理病理活动，可能是T2DM早期诊断的生物标志物和潜在的治疗靶点，差异表达的miRNA表达谱可以作为T2DM预测或疾病进展的良好指标，然而，来自不同研究间的差异需要进一步去证明。如果找到恰当的方法尽可能去控制其混杂因素，将对于开发和应用miRNA提供巨大帮助。