山银花提取物对肉鸡口服氟苯尼考药代动力学及代谢转运相关基因表达的影响

李旭廷，王斌，李思聪，袁定胜，张敏，李金良，梁歌*

(1. 四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2. 动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

氟苯尼考(florfenicol，FFC)是畜禽专用的新型广谱抗菌药，抗菌活性强于氯霉素和甲砜霉素，主要作用机制为抑制细菌70S核糖体，干扰蛋白质的合成[1]。在兽医治疗中，氟苯尼考具有吸收良好、体内分布广泛、抗菌谱广、抗菌作用强的特点，多用于畜禽和水产动物的细菌性疾病，具有良好的治疗效果[2-4]。随着氟苯尼考的持续广泛使用，临床耐药菌株不断增加，新型耐药机制不断发现，不仅降低临床治疗效果甚至对人类健康造成潜在的风险[5]。养殖生产中为了提高疾病治疗效果，常采用氟苯尼考和其他药物联合使用，特别是与中兽药联合应用。研究表明包括细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)、葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、多药耐药蛋白(multidrug resistance protein, MDR1)、乳房癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)以及鸡外源性核受体(CXR)在内的多种代谢酶和外排转运体参与氟苯尼考代谢转运[6-11]。氟苯尼考在与这些代谢酶和转运蛋白的底物、诱导剂或抑制剂联用时有可能改变氟苯尼考药动学特征，影响氟苯尼考药效。因此，开展联用药物对氟苯尼考药代动力学影响的研究，有助于为氟苯尼考临床合理使用提供科学依据，减少药物滥用和耐药性的产生[12]。

山银花性味甘，寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒，散热疏风之功能，作为清热解毒类代表性药物广泛用于温病发热，风热感冒，肺热咳嗽，咽喉肿痛，热毒血痢，乳房肿痛，痈肿疮毒，收载于《中国兽药典》(2015年版，二部)[13]，含有山银花的中兽药制剂广泛用于兽医临床。基于当前中兽药与抗生素联合应用在畜禽养殖实践中普遍存在，山银花与氟苯尼考都是临床常用药物，有必要从中西药相互作用角度，开展山银花对氟苯尼考在鸡体内药动学影响, 探讨可能发生的药动学相互作用及其机制，为临床安全、合理、有效用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药物

山银花提取物(含绿原酸25.4%、灰毡毛忍冬皂苷乙18.6%、川续断皂苷乙1.2%，批号20190601)，由四川鼎尖动物药业有限责任公司提供；氟苯尼考对照品(含量99.1%，批号K0301703)，购自中国兽医药品监察所；氯霉素标准品(含量99.8%，批号130555-201704)，购自中国食品药品检定研究院；氟苯尼考原料药(含量98.9%，批号201710163)，购自浙江康牧药业有限公司；UNlQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒(批号B511321)，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Maxima Reverse Transcriptase(批号P0743)，购自赛默飞世尔科技有限公司。乙腈为色谱纯，乙酸乙酯等其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.2 试验动物与分组

30只50日龄健康大恒699商品肉公鸡，体重(2.50±0.15)kg。试验前观察饲养1周。观察饲养结束后，随机分为对照组和山银花组，每组15只。山银花组连续7 d每天上午9点灌服给药山银花提取物(0.20 g/kg，1次/d)，对照组则给予相应体积的生理盐水。试验全程室温维持在(22±2)℃，湿度(65±5)%，试验鸡自由饮水和采食，饲料为不含任何抗生素的全价日粮。

1.3 山银花提取物对鸡口服氟苯尼考药代动力学影响

1.3.1 给药方案

各组随机选取10只鸡，在禁食12 h后于第8天，按30 mg/kg氟苯尼考(用10%聚乙二醇400溶液制成含氟苯尼考1%的溶液，临用前配制)灌服给药，分别于给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h翅下静脉采集血液约0.5 mL，EDTA抗凝，4 000 r/min离心5 min，分离血浆，置-20 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 样品处理

精确取血浆0.2 mL于试管中，加入10 μL氯霉素内标液(500 μg/mL)和800 μL乙酸乙酯，涡动混合2 min，4 000 r/min离心10 min，吸取上层液于另一离心管中，然后再加入乙酸乙酯800 μL重复提取1次，合并2次提取液。在40 ℃水浴中氮气吹干，残渣加入400 μL流动相溶解，涡动混合2 min，12 000 r/min离心10 min，将上清液转移至进样瓶，取20 μL进样检测。色谱柱：Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(27∶73，V/V)；流速1.0 mL/min；检测波长223 nm；柱温40 ℃。

1.3.3 分析方法与标准曲线

以血浆样品高、中、低(0. 1、2. 5和20 mg/L)3个浓度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度，每个样品做5个重复，测方法回收率和精密度。取空白血浆180 μL，加入20 μL氟苯尼考系列标准溶液，配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列标准血浆样品，按“1.3.2”项下方法处理样品，以氟苯尼考与氯霉素峰面积的比值(s)对相应氟苯尼考浓度(c)作线性回归，求回归方程和相关系数。

1.4 山银花提取物对鸡肝脏和空肠代谢转运相关基因mRNA表达的影响

1.4.1 样品采集

2组各取5只鸡在禁食12 h后于第8天放血处死，分离肝脏和空肠组织于-80 ℃保存。

1.4.2 荧光定量RT-PCR检测鸡肝脏和空肠代谢转运相关基因mRNA表达量

取100 mg组织用组织破碎仪进行破碎，按照说明书用TRIzol法提取组织总RNA。测定样品OD260 nm/OD280 nm比值，确定RNA浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，利用Premier 5.0软件设计CYP3A37、UGT1E、MDR1、CXR和看家基因β-actin引物序列(由上海生工生物公司合成)。实时荧光定量PCR检测上述基因mRNA转录水平，PCR反应体系20 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反应程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，55～61 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共45个循环；60 ℃延伸1 min。结果采用相对定量分析，用2ΔΔCt法计算基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.5 数据统计与分析

由DAS 2.0软件以非房室模型分析方法计算药代动力学参数，采用SPSS 13.0统计软件ANOVA单因素方差法处理数据，所有数据以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 氟苯尼考检测方法专属性、回收率、精密度和标准曲线

本色谱条件下，氟苯尼考保留时间约10.5 min，氯霉素(内标)保留时间约12.4 min。氟苯尼考与内标分离良好，样品处理过程中未引入干扰性杂质，内源性成分不干扰药物的分离测定(图1)。

A. 空白血浆样品色谱；B. 血浆样品色谱(1. 氟苯尼考；2. 内标物)

氟苯尼考在质量浓度为0.05～50 μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为s=0.073 5c-0.014 2，相关系数R2=0.999 7。标准曲线见图2。方法回收率分别为(84.5±2.6)%、(86.3±2.2)%和(85.4±3.4)%，测得日内的相对标准偏差(RSD)分别为4.7%、2.4%和5.6%，测定日间RSD分别为4.8%、3.1%和6.2%。按信噪比S/N=3计算，最低检测限为0.02 μg/mL。

图2 血浆药物浓度标准曲线

2.2 山银花提取物对鸡口服氟苯尼考药代动力学影响

对照组与山银花提取物联用组鸡均按单剂量(30 mg/kg)给予氟苯尼考后，测定不同时间点的氟苯尼考血药浓度，其血药浓度-时间曲线见图3，药代动力学参数见表2。

表2 对照组与山银花提取物联用组在鸡体内的氟苯尼考(30 mg/kg)药动学参数(n=10)

图3 对照组和山银花提取物联用组在鸡体内的氟苯尼考(30 mg/kg)的血药浓度-时间曲线(n=10)

由表3可知，山银花组氟苯尼考的药-时曲线下面积(AUC0～24 h)和平均滞留时间(MRT0～24 h)显著高于对照组相应的AUC0～24 h和MRT0～24 h(P<0.05)；山银花组表观清除率(CLz)显著低于对照组(P<0.05)；最大血药浓度(Cmax)、达峰时间(Tmax)、消除半衰期(t1/2z)和表现分布容积(Vz)与对照组相比无显著差异(P>0.05)。

2.3 山银花提取物对鸡肝脏和空肠不同基因表达的影响

如图4所示，鸡按每千克体重0.20 g连续口服7 d山银花提取物后，肝脏和空肠中CYP3A37、UGT1E和CXR 基因的mRNA水平显著低于对照组(P<0.05)，MDR1的mRNA表达水平差异不显著(P>0.05)。

*表示与对照组比差异显著(P<0.05)

3 讨论

本次试验山银花剂量选择参照《中国兽药典》(2015年版，二部)[13]推荐的鸡的用量1～3 g，以成年肉鸡体重2.5 kg计算，折合提取物用量在0.2 g/kg，按照药物相互作用指导原则和临床中西药联用实际，采用山银花提取物连续口服7 d，氟苯尼考按30 mg/kg一次给药的方式开展研究。联用山银花提取物后AUC0～24 h、MRT0～24 h增加，CLz减少，表明山银花提取物对氟苯尼考吸收有一定促进作用，清除速率有所降低，增加了生物利用度。CYP3A负责超过50%的化合物氧化代谢，是非常重要的I相代谢酶，CYP3A37是禽类CYP3型中的主要亚型[14]。王国永[11]采用酮康唑抑制CYP3A37活性后，氟苯尼考AUC0～t显著提高，清除速率CLz显著下降，采用糖蛋白(P-gp)抑制剂维拉帕米后，氟苯尼考血药Cmax显著上升而AUC0～t无显著差异，表明CYP3A37是氟苯尼考在鸡体内代谢的主要I相代谢酶，而P-gp可影响氟苯尼考吸收过程。本试验结果中山银花提取物显著抑制肝脏和空肠CYP3A37的mRNA表达，可能产生I相代谢酶抑制作用，减少氟苯尼考在肠道中代谢损失，增加氟苯尼考在空肠中的吸收，减缓氟苯尼考体内代谢。

CXR作为核受体家族一员，与哺乳动物孕烷受体(pregnane X receptor, PXR)、雄甾烷受体(constitutive and rostane receptor, CAR)功能相似，都能调控CYP450酶和MDR1基因表达[15-16]。本研究采用实时荧光定量RT-PCR方法检测到肝脏和空肠组织中CYP3A37 mRNA表达水平显著下降，与肝脏和空肠组织中CXR mRNA表达水平下降有一定相关性，佐证了前人研究[16]。但MDR1的mRNA表达水平差异不显著，缺乏与CXR关联性，提示MDR1的调控更为复杂，不仅受CXR通路影响。此外，UGTs是重要的Ⅱ相代谢酶，负责将化学物质葡萄糖醛酸化，增加代谢物水溶性，易于代谢排出[17]。氟苯尼考属于氯霉素类抗生素，在体内可通过UGTs代谢转化[18]。本试验中山银花提取物显著抑制UGT1E的mRNA表达，可能产生Ⅱ相代谢酶的抑制作用，从而调控氟苯尼考体内葡萄糖醛酸化，延缓了氟苯尼考在体内的代谢。

山银花主产于四川、重庆、湖南等南方省市，品种包括灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬和黄褐毛忍冬，与金银花同属忍冬科中药材，二者主治功能、用法用量均完全一致，在长期的临床实践中也经常混用[19]，而山银花产地广、产量大、价格低，探讨山银花在畜禽中的药理药效机制对拓展其在畜牧健康养殖中应用具有显著意义。绿原酸作为山银花和金银花共有的有效成分对CYP450酶活性和P-gp活性影响的研究已见报道。徐文等[20]研究显示绿原酸对重组人CYP3A4酶活性有较强的抑制作用。Pang等[21]研究显示绿原酸在体内对小鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1和CYP3A11的mRNA表达无显著影响，但可体外抑制CYP1A2、CYP2E1酶活性。山银花及其质量控制成分灰毡毛忍冬皂苷乙等对鸡CYP450酶和P-gp活性影响未见研究报道，本试验以鸡为靶动物，联用山银花提取物后，氟苯尼考AUC增加26.0%、MRT延长21.4%、CLz降低18.5%，药代学特征的改变可能与山银花提取物抑制了鸡体内Ⅰ相和Ⅱ代谢酶以及P-gp蛋白表达有关，应进一步探讨其他有效成分对药物代谢酶和P-gp等转运体影响研究。

综上所述，以0.2 g/kg连续7 d口服山银花提取物可使氟苯尼考在鸡体内药代动力学参数(AUC、MRT和CLz)发生显著变化，同时对鸡肝脏和空肠部分代谢转运相关基因如CYP3A37、UGT1E和CXR的mRNA表达有一定抑制作用。