基于UHPLC-MS/MS法测定雪莲中的芦丁和绿原酸含量*

白玛央宗 白玛拉珍 玉珠拉姆 马超**

（1.西藏自治区高原生物研究所；2.西藏职业技术学院，西藏 拉萨 850000）

雪莲是菊科风毛菊属的植物(Saussurea DC),是西藏地区常见的土特产类药材，雪莲有雪莲花(SI)、苞叶雪莲(SO)、绵头雪兔子(SL)、水母雪兔子(SM)、星状雪兔子(SS)和三指雪兔子(ST)等80个品种,大部分品种主要分布在青藏高原及其毗邻地区，包括尼泊尔和印度等地，俄罗斯也有分布[1-3]。雪莲作为一种名贵的药材主要是指雪莲花(SI),《月王药诊》和《木草纲目拾遗》均有对天山雪莲(SI)的记载。雪莲集中生长在海拔较高的流石滩地区，裸露的特殊的生境，容易被发现，尽管海拔高但是容易采挖，一度濒危[4]。

研究显示雪莲有良好的消炎止痛、抗肿瘤、抗氧化、降血脂等作用[5]，并含有如黄酮类、木脂素类、酚醛类、苯丙素类和倍半萜类化合物等生物活性物质[6-8]。现行中国药典采用HPLC 法测定天山雪莲中芦丁和绿原酸含量作为标准[9]；达娃卓玛等采用HPLC-DAD–ESI-MSn分析了不同产地三指雪兔子中8 种物质的含量[10]，以期达到规范检查方法并应用到其他品种的目的；王强等采用高效液相色谱法测定10 批不同产地天山雪莲中绿原酸和芦丁的含量[11]；史俊友等采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 比色法对大苞雪莲、绵头雪莲及水母雪莲中总黄酮含量进行测定[12]。本实验通过UHPLC-MS/MS 法对不同来源雪莲中的药典标志性成分含量进行检测和评价，筛选优质雪莲藏药材，以期为雪莲质量控制和针对性保护开发提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

20 份雪莲样品，其中1～15 号购自拉萨、林芝等地的农牧民及特产店，16～19 号样品为课题组于2020 年7月采集，标本现存于西藏自治区高原生物研究所，20号为天山雪莲。

1.2 试剂

标准物质绿原酸和芦丁质量分数均≥98%，甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵都为色谱纯，均购自百灵威科技有限公司。

1.3 仪器试剂

Waters Xevo TQ-S+ACQUITY UPLC 液质联用仪（美国Waters 公司）；TG 16 台式高速离心机(四川蜀科仪器有限公司)；MILLI-Q INTEGRAL 15 纯水/超纯水系统(美国Millipore 公司)；CPA225D 电子天平(德国Sartorius 公司)；LD-500 摇摆式中药粉碎机（长沙市常宏制药机械设备厂）；HYC-356医用冷藏箱（青岛海尔特种电器有限公司）；Eppendorf移液器（德国艾本德有限公司）；KQ5200DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XW-80A 旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液制备。样品采用中药粉碎机粉碎，用天平称取样品粉末0.10g，溶于10mL80%甲醇中，涡旋混匀后超声提取40min，补足减失质量，室温下8000rpm 离心5min，取上清液经0.22µm 微孔滤膜滤过，用80%甲醇分别稀释10 倍、100 倍、1000 倍，然后转移至96孔进样板进样。

2.1.2 标准品溶液的制备。精密称取芦丁、绿原酸标准品适量，分别置于10mL棕色容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，配成便准品溶液。次稀释该标准溶液得到一系列校准溶液。

以上溶液均置于4℃冰箱冷藏备用。

2.2 色谱质谱条件

2.2.1 色谱条件。色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP 色谱柱(100mm×2.1mm,2.6µm)；流动相A：0.1%甲酸水（含5mM甲酸铵），流动相B：甲醇（含5mM甲酸铵），梯度洗脱5.5min。柱温：35℃，进样量3µL，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 质谱条件。离子源电喷雾离子源（ESI），正离子模式；喷雾毛细管电压：3.0KV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流速：800L/Hr；离子源温度：150℃；扫描模式：MRM；绿原酸和芦丁的离子对信息见表2。

表2 标准物质的质谱参数

2.3 线性关系、检测限和定量限试验

取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），用内标法进行线性回归，计算相关系数并得到回归方程；通过其信噪比来计算检出限和定量限，检测限和定量限分别在信噪比为3 和10 时测定。结果显示芦丁和绿原酸线性关系良好，灵敏可靠，见表3。

表3 线性关系、检测限和定量限

2.4 精密度试验

取“2.1.2”项下的对照品溶液适量，在“2.2”项条件下连续进样6次，测定各待测成分的峰面积，以峰面积的相对标准偏差（RSD），结果（表4）显示均小于3%，表明该方法精密度良好。

表4 精确度、重复性、稳定性

2.5 重复性试验

根据“2.1.1”项下的方法，取同一样品制备6 份供试品溶液，在“2.2”项条件下进样，测定各成分峰面积的相对标准偏差（RSD），结果（结果）显示均小于5.2%，表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取“2.1.1”项下供试品溶液适量，室温下放置，第1 天、第2 天、第3 天分别按“2.2”项下试验条件进样，记录各成分峰面积并计算其相对标准偏差（RSD），结果显示，都小于3.4%，表明上述溶液稳定性良好。

2.7 加标回收率

取混合对照品溶液，按“2.2”项下方法测定连续进样6 次，计算平均回收率，结果（表5）显示各成分平均回收率为90%～108%，RSD 小于3.4%，表明本方法准确度良好。

表5 加标回收率

2.8 含量测定

取不同的雪莲样品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项色谱条件下进样分析，平行测定3 次，测定各样品中绿原酸和芦丁的含量，结果（表6）发现20份雪莲样品都含有较高含量的绿原酸，其中采自察隅县的18 号雪莲样品的绿原酸含量最高（10692.1µg/g），而芦丁含量相差较大，天山雪莲的芦丁含量最高（6468.821µg/g），1、4、10、17雪莲样品几乎不含芦丁。

表6 样品含量测定结果

3 讨论

本研究建立了不同来源西藏雪莲中芦丁和绿原酸含量的UHPLC-MS/MS 测定方法，并与同样测定方法下的天山雪莲进行对照比较，发现天山雪莲的芦丁含量占优势，而西藏雪莲的绿原酸含量普遍较高且有4 个样品的绿原酸含量高于天山雪莲。中国药典（2020 年版）要求天山雪莲中无水芦丁和绿原酸的含量均不得少于0.15%，采自察隅县的18 号雪莲样品满足这一条件的同时，绿原酸含量明显高于天山雪莲样品。为雪莲的深入研究和开发利用提供参考的同时，为其质量控制提供了一种新的模式。