响应面优化超声辅助提取黄秋葵嫩果黄酮工艺及其清除羟自由基能力

闫旭宇，李娟，李玲

(延安大学 生命科学学院 陕西省红枣重点实验室，陕西 延安 716000)

黄秋葵(AbelmoschusesculentusL.)属于锦葵科秋葵属一年生草本植物，又名秋葵、补肾草，在我国大部分地区均有种植。黄秋葵作为药食两用植物，以嫩果供食用，富含黄酮、多糖、果胶、微量元素、氨基酸等功效成分，具有保肝强肾、降低血糖、清火明目、健胃润肠、帮助消化、抗疲劳、抗衰老、增强人体免疫力等功能，在食品及调味品领域有着广泛的应用[1-2]。

黄酮类化合物是一种天然的有效活性成分，在食品加工中广泛用于各种调味食品和保健食品的生产[3]，具有抗氧化、消炎抑菌、抗肿瘤、降血糖、提高机体免疫力等多种生物活性[4-6]。黄酮类化合物大多含有羟基、甲氧基和异戊烯基等，易溶解于极性较大的有机溶剂。因此，利用乙醇等无毒且易回收的有机溶剂提取黄酮是常用的提取方法之一，而微波、超声波、加酶等辅助手段有利于提高有机溶剂的提取效率，尤其是超声波操作简单、容易控制，通过物理方法破坏植物的细胞壁，不易造成化学污染，缩短提取时间，提高活性成分溶解率和得率[7-8]。同时，黄酮类化合物特有的结构决定了其捕获活性氧等自由基的能力较强，可作为一种天然、安全、有效的抗氧化剂，减轻过量自由基对机体的损害，进而降低心血管疾病、糖尿病、肿瘤等多种疾病及并发症的发生[9]。因此，在考虑成本的情况下，采用超声辅助乙醇提取黄秋葵嫩果黄酮，有助于提高黄酮得率。

黄秋葵作为药食两用植物，因其良好的功能和保健作用而愈发受到人们的喜爱，其种植推广面积逐年增长[10]。因此，深度加工与开发黄秋葵对提高其附加值及资源的利用率具有重要意义。本研究以黄秋葵嫩果为材料，以黄酮得率为指标，利用超声辅助乙醇提取黄秋葵嫩果黄酮，用响应面设计优化黄秋葵嫩果黄酮的提取工艺条件，并初步研究黄酮对羟自由基的清除作用，以期为进一步开发利用黄秋葵资源提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与试剂

黄秋葵嫩果：产自陕西延安。

无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、抗坏血酸等试剂(均为国产分析纯)：陕西和平化玻有限公司；芦丁标准品(HPLC≥98%)：上海一基生物试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

FW-100D型植物粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司；UV-2600型紫外可见分光光度计、AUX220型分析天平 日本岛津公司；WG-71型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；KQ500B型超声波清洗仪 昆山超声仪器有限公司；SHZ-D Ⅲ型循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；RE-52CS型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 黄秋葵嫩果黄酮的提取工艺流程

黄秋葵嫩果→清洗→去梗→切片→60 ℃烘干至恒重→粉碎→过筛(60目)→黄秋葵干粉→超声辅助乙醇回流提取(250 W)→提取2次合并粗提液→室温减压抽滤→滤液旋蒸→定容→提取液。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制及黄秋葵嫩果黄酮得率的计算

参照闫旭宇等的方法绘制芦丁标准曲线。以芦丁为标准品，在已配制好的不同浓度的标准溶液中，依次加入Na(NO2)、Al(NO3)3、NaOH溶液，发生显色反应。以不加芦丁对照品溶液为参比，在510 nm处测吸光度，以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程y=1.425x+0.0028，R2=0.9965。

采用Na(NO2)-Al(NO3)3-NaOH法测定总黄酮[11]。根据回归方程计算出提取液中黄酮的质量浓度，再按照公式(1)计算黄秋葵嫩果黄酮的得率(%)：

(1)

式中：Y为黄酮得率，%；C为提取液中黄酮浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数；M为称量的黄秋葵嫩果粉末质量，g。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 乙醇浓度对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响

称取5.0 g干燥的黄秋葵嫩果粉末5份，分别加入料液比为1∶30(g/mL)的浓度为55%、60%、65%、70%、75%的乙醇，在60 ℃的条件下超声30 min，研究乙醇浓度对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响。

1.2.3.2 料液比对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响

称取5.0 g干燥的黄秋葵嫩果粉末5份，分别加入料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)的浓度为65%的乙醇，在60 ℃的条件下超声30 min，研究料液比对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响。

1.2.3.3 提取温度对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响

称取5.0 g干燥的黄秋葵嫩果粉末5份，分别加入料液比为1∶30(g/mL)的浓度为65%的乙醇，分别在50，55，60，65，70 ℃的条件下超声30 min，研究提取温度对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响。

1.2.3.4 超声时间对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响

称取5.0 g干燥的黄秋葵嫩果粉末5份，分别加入料液比为1∶30(g/mL)的浓度为65%的乙醇，在60 ℃的条件下超声20，25，30，35，40 min，研究超声时间对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响。

1.2.4 响应面优化试验设计

在单因素试验基础上，以黄酮得率为响应值，对影响黄秋葵嫩果黄酮得率的乙醇浓度、料液比、提取温度和超声时间4个因素的3个水平进行响应面优化试验，确定超声波辅助提取黄秋葵嫩果黄酮的最佳工艺条件。各因素的水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.5 黄秋葵嫩果黄酮清除羟自由基试验

黄秋葵嫩果黄酮及Vc对羟基自由基(·OH)的清除率采用水杨酸法进行测定。其中，黄酮浓度(mg/mL)以黄酮含量计算。·OH的清除率计算公式如下：

(2)

式中：E为·OH的清除率(%)；A0为空白对照液的吸光值；Am为加入黄酮后的吸光值；An为不加H2O2时黄酮的吸光值。

1.3 数据处理

采用响应面分析软件Design Expert V8.0.6.1的Box-Behnken Design进行试验设计及数据分析，采用 Excel 2003软件进行数据统计分析，数据表示为“平均值±标准差”形式。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1可知，随着乙醇浓度的提高，黄秋葵嫩果黄酮得率逐渐增加，在65%时达到最高，之后黄酮得率逐渐降低。较高的乙醇浓度会增加其他可溶性物质如蛋白质、儿茶素等的溶出量，降低黄酮相对含量[12]。黄秋葵嫩果黄酮得率随着提取液体积的增加而增加，料液比为1∶30(g/mL)时的得率略低于1∶35(g/mL)和1∶40(g/mL)时的得率，但考虑到成本，料液比的适宜取值为1∶30(g/mL)。随着提取温度由50 ℃上升到60 ℃，黄秋葵嫩果黄酮得率直线上升，在60 ℃时得率最大，高于60 ℃时得率明显下降。温度较低时黄酮溶出较慢，但温度较高时会导致杂质溶出增多，且影响黄酮的稳定性[13]。随着超声时间的延长，黄秋葵嫩果黄酮得率先升后降，在30 min时达到最大值，之后黄酮得率明显下降。超声提取时间过长不仅增加能耗，而且消耗溶剂并影响黄酮的稳定性和相对含量[14]。因此，考虑到提取成本和黄酮的相对稳定性，选择4个因素的3个较适宜水平，即乙醇浓度(60%、65%、70%)、料液比(1∶25、1∶30、1∶35，g/mL)、提取温度(55，60，65 ℃)、超声时间(25，30，35 min)进行响应面分析。

图1 乙醇浓度、料液比、提取温度、超声时间不同水平下的黄酮得率Fig.1 The yield of flavonoids under different ethanol concentration, solid-liquid ratios, extraction temperatures and ultrasonic time

2.2 响应面设计优化分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

黄秋葵嫩果黄酮提取响应面设计方案及试验结果见表2，回归模型方差分析见表3。在响应面试验结果的基础上，采用Design Expert 8.0.6软件进行多元拟合回归分析，得到黄秋葵嫩果黄酮得率对乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取温度(C)和超声时间(D)的四元二次回归模型方程：

Y=4.60+0.13A+0.15B+0.068C+0.074D+0.12AB+0.035AC+0.032AD-0.038BC+0.012BD-0.13CD-0.33A2-0.25B2-0.28C2-0.2D2。

表2 黄秋葵嫩果黄酮提取响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results of flavonoids extracted from tender okra fruit

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

续 表

方程的决定系数R2=0.9738，说明有97.38%的响应值变化来源于4个试验因素，回归模型方程拟合度良好，预测值与实测值之间的相关性较好，试验误差较小，说明此方程较准确可靠，可很好地描述各因素与响应值之间的关系并预测黄秋葵嫩果黄酮的最优提取条件[15]。

由表3回归模型方差分析结果可知，模型的P<0.0001，极显著，说明该模型有意义；失拟项的P>0.05，不显著，说明模型与试验的差异值较小，可以作为预测黄秋葵嫩果黄酮最优提取工艺参数的模型。回归模型方差分析中一次项的PA、PB、PC、PD、PAB、PCD、PA2、PB2、PC2、PD2值均小于0.01，说明4个因素的一次项和二次项、乙醇浓度和料液比以及提取温度和超声时间的交互项均存在显著性，而因素间的交互项及失拟项显著性相对较差。表明4个因素对响应值黄酮得率均存在显著影响，其关系是一种非线性关系[16]。由方程一次项及F值可知，影响黄秋葵嫩果黄酮得率的因素顺序为：料液比>乙醇浓度>超声时间>提取温度。

2.2.2 响应面因素间交互作用分析

由表3方差分析可知，乙醇浓度和料液比以及提取温度和超声时间的交互作用对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响达到极显著水平(P<0.01)。为更直观形象地说明其交互影响作用，利用Design Expert 8.0.6软件做出交互项的等高线图和响应曲面图，见图2。

图2 乙醇浓度和料液比、提取温度和超声时间对黄秋葵嫩果黄酮得率的交互影响Fig.2 Effect of interaction of ethanol concentration and solid-liquid ratio, extraction temperature and ultrasonic time on yield of flavonoids from tender okra fruit

由图2可知，乙醇浓度和料液比相互作用的响应面曲面坡度较陡峭，等高线呈扁平椭圆状，说明乙醇浓度和料液比之间的相互作用对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响显著；提取温度和超声时间相互作用的响应面亦较陡峭，等高线基本呈扁平椭圆状，表明提取温度和超声时间的相互作用较强，对黄秋葵嫩果黄酮得率的影响亦显著，但相对次于乙醇浓度和料液比之间相互作用对响应值的影响。

2.2.3 响应面试验模型与提取条件验证

用Design Expert 8.0.6软件进一步分析回归方程，得出黄秋葵嫩果黄酮提取的最适条件为：乙醇浓度65.28%、料液比1∶30.36(g/mL)、提取温度60.07 ℃、超声时间30.2 min，预测得率为4.652%。考虑到实际操作的局限性，提取工艺最终修正为：乙醇浓度66%、料液比1∶31(g/mL)、提取温度60 ℃、超声时间31 min。在此条件下进行试验验证，重复试验3次，黄秋葵嫩果黄酮实际得率为4.71%，与预测值(4.652%)接近，其相对误差为1.25%，表明由Box-Behnken试验设计所得的黄秋葵嫩果黄酮的最佳提取工艺条件准确可靠。本试验中超声辅助乙醇提取黄秋葵嫩果黄酮得率高于正交试验优化乙醇提取的黄酮得率3.30%[17]，以及高于微波辅助提取的黄酮得率2.78%[18]，这说明与单纯的乙醇提取法相比，适宜的超声提取功率有助于黄秋葵嫩果黄酮的最大溶出，且提取效果好于微波辅助提取。但在相同的提取方法下，本试验的得率略低于李加兴等的得率4.85%[19]，这可能与提取条件不同以及选取材料的不同有关。

2.3 黄秋葵嫩果黄酮对羟自由基的清除作用

生物类黄酮具有较强的清除自由基和抗氧化能力，研制经济有效的天然黄酮类抗氧化剂替代食品中常用的人工合成抗氧化剂是防治羟基自由基诱发疾病的重要途径[20]。

由图3可知，黄秋葵嫩果黄酮对·OH的清除率随着黄酮浓度的增加而逐渐增加，清除·OH能力与浓度存在一定的量效关系。在相同浓度下，黄秋葵嫩果黄酮对·OH的清除率高于Vc，说明黄秋葵嫩果黄酮具有一定的抗氧化能力。

图3 黄秋葵嫩果黄酮对羟自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging ability of flavonoids extracted from tender okra fruit

3 结论

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken法设计响应面优化试验，得出影响超声辅助乙醇提取黄秋葵嫩果黄酮的因素依次为：料液比>乙醇浓度>超声时间>提取温度，乙醇浓度和料液比以及提取温度和超声时间对黄秋葵嫩果黄酮得率的交互影响较强。优化得出的黄秋葵嫩果黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度66%、料液比1∶31(g/mL)、提取温度60 ℃、超声时间31 min，在此条件下，黄秋葵嫩果黄酮得率为4.71%。通过对羟自由基的清除试验发现，在相同质量浓度下，黄秋葵嫩果黄酮提取物对羟自由基的清除效果高于Vc，表明黄秋葵嫩果黄酮具有较强的抗氧化能力，可以作为一种羟基自由基的天然清除剂进行开发应用。本研究结果为黄秋葵嫩果黄酮的规模化提取和开发应用提供了理论参考。