红果肉苹果‘红脆甜’二倍体和四倍体叶片显微结构差异分析

马荣群，葛红娟，黄粤，孙红涛，张蕊芬，孙吉禄，万述伟，沙广利

（青岛市农业科学研究院，山东 青岛 266100）

果树多倍体品种一般具有生长旺盛、果实大、产量高和抗逆性强等特点［1］，且能够利用无性繁殖方式保持其优良性状。果树多倍体育种是创造果树新品种的重要途径之一。同源多倍体可直接育成品种，也可以在品种改良中充当中间材料，或在多倍体水平进行杂种优势利用，以及用于创造新的种质资源等［2］。红果肉苹果因富含具抗氧化作用的黄酮类色素花青苷而备受人们青睐。

‘红脆甜’是青岛市农业科学研究院育成的红果肉苹果二倍体品种，果实口感酸甜，且早花早果、植株干性强，高抗白粉病。前期本课题组以‘红脆甜’为材料，通过秋水仙素诱导结合叶片离体再生，获得其同源四倍体植株［3］，移栽到温室后观察发现，‘红脆甜’四倍体植株较二倍体植株的生物学性状表现发生了明显变化，叶片形状、叶片颜色以及植株高度等明显区别于二倍体，类似于已报道的寒富苹果［4］、大青杨［5］、枇杷［6］等的同源四倍体的表现。目前有关红果肉苹果‘红脆甜’二倍体及其同源四倍体叶片显微结构差异的研究还未见报道。本研究对移栽至温室的一年生‘红脆甜’二倍体及同源四倍体的植株性状和叶片显微结构进行调查，并对二者间的差异进行分析，以期为深入探讨红果肉苹果多倍体特性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为青岛市农业科学研究院苹果砧木课题组自主选育的红果肉苹果‘红脆甜’（CK）以及经诱导鉴定的其3个同源四倍体材料F38、F50、F51。2019年6月，组培苗定植于现代化玻璃温室；2020年9月，取温室一年生‘红脆甜’组培苗植株功能叶片为试验材料进行相关观察。

1.2 试验方法

1.2.1 表皮细胞及气孔器的密度观察 用镊子轻轻撕取叶片上下表皮置于载玻片上，滴加I2－KI溶液染色30 s，加盖玻片制成临时装片，在荧光显微镜拍照系统（WT－1000GM）放大100倍进行观察，四倍体和二倍体各取30个视野，分别记录表皮细胞数和气孔器数，取平均值，计算每个视野的平均表皮细胞数及气孔器数目。

1.2.2 叶片结构观察 将叶片剪为1.0 cm×1.0 cm小块，立即置于Carnoy’s固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）中固定至叶片完全褪绿。采用常规石蜡切片制片，荧光显微镜镜检拍照，记录100倍视野下叶片厚度、叶片主脉厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上下表皮细胞厚度等。

1.2.3 植株性状调查 2019年6月6日，同时将‘红脆甜’二倍体及其同源四倍体组培苗定植于玻璃温室，2020年9月4日调查植株性状，测量株高、茎粗、叶片长度和宽度。茎粗为地面上20 cm处茎的粗度，叶片测量第8～10片叶。温室管理肥水充足。

2 结果与分析

2.1 叶片表皮细胞及气孔器密度比较

由表1可知，二倍体表皮细胞平均密度为91.67个/视野，四倍体表皮细胞平均密度（46.00个/视野）比二倍体表皮细胞密度减少了49.82%。二倍体表皮气孔器平均密度为30个/视野，而四倍体表皮气孔器密度为16个/视野，比二倍体叶片表皮气孔器密度减少了46.67%。由图1、图2可见，相比于红果肉苹果‘红脆甜’二倍体，四倍体植株叶片的表皮细胞和气孔器同步变大，从而使得密度变小。

图2 二倍体（左）和四倍体（右）气孔器

表1 ‘红脆甜’二倍体、四倍体表皮细胞及气孔器密度差异

图1 二倍体（左）和四倍体（右）上表皮细胞

2.2 叶片横切解剖结构特征比较

由图3可见，‘红脆甜’二倍体（CK）和四倍体（F38、F50、F51）叶片上、下表皮均由1层细胞组成，上表皮较下表皮排列整齐；叶肉细胞中栅栏组织分两层，多为长椭圆形，排列紧密厚实，海绵组织排列松散，形状不规则。如表2所示，与二倍体相比，四倍体上下表皮、栅栏组织和海绵组织厚度都显著增加，其中，上表皮厚度增加58.37%～78.58%，下表皮厚度增加39.95%～63.19%，栅栏组织厚度增加41.75%～64.64%，海绵组织厚度增加25.62%～39.87%，表现出明显的多倍体特征（表2）。

图3 ‘红脆甜’二倍体（CK）与四倍体（F38、F50、F51）植株叶片横切面

表2 二倍体与四倍性植株叶片横切面结构特征差异

2.3 植株性状差异分析

在同一温室生长环境和相同栽培管理条件下，同期定植的‘红脆甜’二倍体和四倍体组培苗植株生长量表现出明显差异:二倍体植株生长旺盛，株高达到2 m多，而四倍体植株则表现出明显的矮化，同一发育时期株高还不足1 m，节间短缩，具有明显的多倍体矮化特性（表3）。

表3 二倍体和四倍体两年生植株性状差异

3 讨论与结论

红果肉苹果‘红脆甜’经染色体加倍后，显微镜单位视野内叶片的表皮细胞和气孔器体积均增大，密度明显变小，因此，可将叶片表皮细胞和气孔器密度的变化作为快速判断染色体是否成功加倍的方法之一，用于大批量多倍体诱导再生植株的快速筛选。较之流式细胞仪和根尖染色体计数法，本试验所用镜检叶片表皮细胞和气孔器密度变化的方法操作简单、取材方便，适用于对疑似加倍植株的大规模初筛。

叶片性状与植物对环境的适应及自我调控能力有关，叶片性状如何响应和适应气候变化是植物适应性研究的重点内容。有研究表明，叶片的栅栏组织是评价植物抗旱性的重要指标之一［7，8］，上表皮 厚度是 评价抗 旱性的 代表性 指标［9］，栅栏组织厚度和上表皮厚度是评价菊花抗寒性的重要指标［10］。本研究叶片横切解剖结构显示，成功加倍的‘红脆甜’四倍体叶片上下表皮、栅栏组织、海绵组织等结构的厚度均较二倍体显著增加，这使得植株的抗寒性和抗旱性等抗逆性状发生相应变化。‘红脆甜’四倍体的抗逆性评价也是下一步的研究目标。

本研究一年生‘红脆甜’四倍体和二倍体植株高度差异极显著，四倍体植株表现出明显的矮化特性，今后可以四倍体为砧木嫁接苹果，研究其对接穗的影响及栽培效果，评价其作为苹果矮化砧木的潜力和可行性，为苹果矮化栽培集约化模式提供参考。