响应面法优化狮头柑果皮总黄酮提取工艺

王 杰，张鹏锋,2，赵小娜，张云云，鲁周民*

(1.西北农林科技大学 林学院，陕西 杨陵 712100；2.榆林市榆阳区森林防火保障中心，陕西 榆林 719000)

狮头柑(Citrusreticulata)为芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)亚热带常绿果树，因其果皮皱起形如“狮头”而得名[1]。狮头柑是安康市地方名优果品，栽培历史悠久，主要分布在汉江、旬河沿线[2]，宋代时已在安康广泛栽培，历经千年形成了独具特色的地方栽培品种[3]。狮头柑果树常绿，单株产量高，盛果期长，果肉甘酸可口，但后味微苦，具有明神降火、生津润肺、清热理气等医疗保健功效[4]。据西北农林科技大学、农科院校区测试中心2003年10月对旬阳狮头柑检测表明果实含蛋白质0.96%、VC约0.12 mg·100g-1、Ca 147.4 mg·kg-1、P 166.9 mg·kg-1、Fe 2.31 mg·kg-1，未检出砷、铅、汞等有毒物质[5]。孟瑶瑶等[6]研究了狮头柑籽油提取技术，优化提取工艺为：料液比1∶100(g·mL-1)，提取温度49℃，提取时间7 h。张涵等[4]对狮头柑果皮中的香气进行了提取分析和鉴定，认为狮头柑皮中香气成分主要是烃类、醛类、酮类、醇类、酯类、芳香族化合物。狮头柑在旬阳县已成为全县主导产业之一[7]，狮头柑全身是宝，其根、叶、果皮均可入药，有消食化痰、理气养胃等功效，其树体木材坚实致密，可制作优良家具[8]。

植物源性黄酮化合物的生物活性越来越受关注[9]，其具有很好的抗炎活性、抗病毒活性[10]、抑菌性[11]、抗氧化[12]、抗过敏[13]、降血糖[14]等功效，柑橘属的黄酮类化合物含量丰富，易分离[15]，已成为人们的研究重点之一。目前对狮头柑的相关研究报道有良种选育技术[16]、常见虫害防治[17]、标准化建园及高产栽培技术[2,18]，产业发展的分析与建议[17,19]，对狮头柑的营养价值、保健功能和生物活性物质的分析及资源的利用等方面研究相对较少。本研究对狮头柑果皮的总黄酮提取工艺进行优化，为狮头柑资源能更好的开发利用提供新思路。

试验结果表明，狮头柑果皮中总黄酮含量远>果肉，故以安康狮头柑果皮为试验材料，采用超声波辅助提取总黄酮，利于黄酮类化合物渗出[20-21]，通过响应面法和数理统计方法来优化提取工艺，为狮头柑的进一步利用和开发，更好地发挥其经济和药用价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狮头柑样品采集于陕西省安康市关庙镇红专村安康北亚热带经济林果树试验示范站，均为随机采摘。

主要试剂：无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠均为分析纯，芦丁为分析标准品，试剂均来自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

数显卡尺，上海九量五金工具有限公司；JJ500Y型电子天平，精度0.01 g，常熟市双杰测试仪器厂；DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；R200D型电子分析天平，精度0.000 001，德国Sartorious公司；DGG-9140型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；A1330011型Beckman离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；超纯水器，成都越纯科技有限公司；BCD-215DC型冰箱，中国海尔集团；KH-500DE型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；IKA-A11基本型批量式分析研磨仪，德国IKA集团；MULTISKAN-GO型全波长酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的处理 将所采狮头柑样品洗净晾干，随机取果实20个，分离果肉和果皮，用液氮将果皮进行速冻粉碎，所选狮头柑应保证随机性，分装并标明编号，放置于-80℃冰箱中备用。

1.3.2 狮头柑总黄酮提取的单因素试验

1)准确称取狮头柑果皮样品0.200 0 g各6份于10 mL离心管中，分别加入5 mL 75%乙醇，在超声功率70 W，提取温度为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下超声提取60 min，计算总黄酮得率来确定提取温度。

2)不同提取时间对狮头柑总黄酮得率的影响 准确称取狮头柑果皮样品0.200 0 g各6份于10 mL离心管中，分别加入5 mL 75%乙醇，在提取温度55℃、超声功率70 W下超声提取20、30、40、50、60、70 min，计算总黄酮得率来确定提取时间。

3)准确称取狮头柑果皮样品0.2000 g各6份于10 mL离心管中，分别加入3、5、7、9、10 mL 75%乙醇，在提取温度55℃、提取时间30 min、超声功率70 W下提取，计算总黄酮得率来确定料液比。

4)准确称取狮头柑果皮样品0.200 0 g各6份于10 mL离心管中，加入7 mL的75%乙醇，提取温度55℃、提取时间30 min保持不变，在超声功率50、60、70、80、90、100 W条件下提取，计算总黄酮得率来确定超声功率。

1.3.3 狮头柑总黄酮提取的响应面优化试验 以单因素试验的结果为依据，料液比为1∶35(g∶mL-1)，以提取温度(A)、提取时间(B)、超声功率(C)作为考察因子，以狮头柑总黄酮得率(Y)为试验指标，进行响应面试验，因素及水平编码见表1。

表1 狮头柑果皮响应面试验因素及水平编码Table 1 Factor and levels coding of Box-Behnken Design from peel of Shitougan

1.3.4 指标测定方法

1.3.4.1 标准品的制备 芦丁标准曲线的绘制采用应用广泛的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[22]，但有所改动。精确称取芦丁标准品0.030 0 g于100 mL容量瓶中，加入一定量的75%乙醇将其溶解并定容，摇匀后即制成质量浓度为300 μg·mL-1的芦丁标准溶液，置于-18℃下保存备用。

1.3.4.2 标准曲线的绘制 取7支20 mL具塞试管依次为1～7号，用移液枪分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的芦丁标准溶液，加一定量的75%乙醇补至3 mL，摇匀后加入1 mL 5% NaNO2于各试管中，放置6 min后加入1 mL 10% Al(NO3)3于各试管中，放置6 min后加入10 mL的1 mol·L-1NaOH溶液于各试管中，定容摇匀后静置15 min，以空白液为参比，以芦丁标准溶液的质量浓度为横坐标(X)、吸光度A为纵坐标(Y)于510 nm波长下测定吸光度，来绘制标准曲线，并计算回归方程[4]。

1.3.4.3 样品的测定 样品提取方法同以上单因素试验方法，提取后冷却至室温，4 500 r·min-1离心20 min，取上清液1 mL并用75%乙醇稀释至10 mL，再吸取1 mL进行显色，测定吸光度，按标准曲线计算其总黄酮的质量浓度，总黄酮得率计算公式：

(1)

式中：ρn为显色液中总黄酮的质量浓度/μg·mL-1；V为显色液的体积/mL；M为样品的质量/g；N为稀释倍数。

1.4 数据处理分析

采用Excel2016和DPS7.55软件对所得数据进行整理和分析，在单因素试验基础上按Box- Behnken组合试验设计原理，采用Design Expert 10.0.3.1分析拟合数据并进行二次回归响应面分析，建立多元二次响应面回归模型。

2 结果与分析

2.1 狮头柑总黄酮提取的单因素试验结果

2.1.1 提取温度对狮头柑总黄酮得率的影响 由图1可知，狮头柑提取温度为35℃时总黄酮得率最低为0.86%，随着提取温度的上升，总黄酮得率也增加，在55℃时为最大值2.07%，原因可能为随着提取温度的上升，分子热运动逐渐加剧，超声空化引起的湍流效应可使边界层变薄，黄酮类化合物的传质速率和扩散系数增加[23]，有利于黄酮类化合物的渗出扩散；但是随着提取温度的继续上升，总黄酮得率开始缓慢下降，在60℃时总黄酮得率下降到1.95%，可能由于提取温度过高，使对热敏感的黄酮类化合物受热分解[24]，同时一部分乙醇挥发，造成料液比增大，黄酮类化合物提取量减少[25]，从而降低总黄酮得率。

图1 提取温度对狮头柑果皮总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.2 提取时间对狮头柑总黄酮得率的影响 由图2可知，狮头柑总黄酮得率随提取时间的增加而增加，在提取时间为30 min时总黄酮得率为最大值2.48%，原因可能为随着时间的增加，提取溶剂与反应物中的黄酮类化合物浓度差导致持续扩散；但随着提取时间的继续增加，总黄酮得率开始缓慢下降，在提取时间为60 min时，总黄酮得率下降到2.02%，可能是提取时间的过长，黄酮类化合物持续析出使浓度梯度降低，同时对热敏感的黄酮类化合物水解[24]，从而降低总黄酮得率。

图2 提取时间对狮头柑果皮总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction duration on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.3 料液比对狮头柑总黄酮得率的影响 由图3可知，狮头柑总黄酮得率随着料液比的增加而增加，二者呈正相关，在料液比为1∶35(g∶mL-1)时总黄酮得率趋于稳定为2.61%，原因可能为提取溶剂与反应物中的黄酮类化合物浓度差持续存在，使其中的黄酮类化合物持续扩散，同时加大了提取溶剂与反应物的接触面积[26]，但随着料液比的进一步增加，总黄酮得率增加缓慢且趋于稳定，可能是随着料液比的增加，使内外渗透压趋近稳定，总黄酮化合物的传质扩散趋于稳定状态[27]，同时随着提取溶剂的增加，黄酮类化合物的扩散所需时间也会增加[28]，所以在限定时间内总黄酮得率增加缓慢，考虑到提取溶剂的增加会造成资源浪费，且对提纯造成困难，所以采用料液比1∶35(g∶mL-1)最为适宜。

图3 料液比对狮头柑果皮总黄酮得率的影响Fig.3 Effect ofsolid-liquid ratio on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.4 超声功率对狮头柑总黄酮得率的影响 由图4可知，狮头柑总黄酮得率先随着超声功率的增加而增加，在70 W时达到最大值2.11%，原因可能为随着超声功率的增加，超声空化效应产生的机械效应使细胞破碎充分[29]，媒介粒子的速度增大使界面扩散层上分子扩散速率增大[30]，导致黄酮类化合物扩散量和扩散速度增加；但随着超声功率的继续增加，总黄酮得率开始下降，可能是超声功率的增大会破坏某些苷体的稳定性[31]，从而降低总黄酮得率。

图4 超声功率对狮头柑果皮总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasound power on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.2 狮头柑总黄酮提取的响应面优化试验结果

2.2.1 响应面模型拟合与显著性分析检验 根据单因素试验结果为依据，以提取温度(A)、提取时间(B)、超声功率(C)为自变量，以总黄酮得率(Y)为响应值，进行Box-Benhnken试验设计，各试验均有17个试验点，其中包括12个析因点、5个中心点，中心试验均重复5次来估计纯试验误差。

对表2进行多元回归拟合分析，可得到二次多元回归拟合方程：

表2 狮头柑果皮Box-Benhnken试验设计及结果Table 2 Results of Box-Benhnken Design from peel of Shitougan

Y=2.27+0.048×A+0.14×B+0.012×C-0.007 5×A×B+0.002 5×A×C+0.017×B×C-0.065×A2-0.25×B2-0.13×C2(R2=0.975 9)

(2)

对此模型方程进行显著性分析检验(表3)，可知模型P<0.01，说明该模型差异极显著，其模拟性良好。一次项中A的偏回归系数显著(P<0.05)，说明提取温度对总黄酮得率有显著性影响，B的偏回归系数极显著(P<0.01)，说明提取时间对总黄酮得率有极显著影响，而C的偏回归系数不显著(P>0.05)，说明超声功率对总黄酮得率没有显著影响；交互项中交互作用均不显著；二次项中，A2对总黄酮得率影响显著，B2、C2对总黄酮得率均有极显著影响。该模型的回归系数R2=0.975 9说明该模型响应值变化的97.59%来自自变量，失拟项P=0.450 9>0.05，说明该模型对自变量拟合良好，能较好地描述各自变量与响应值之间的关系。剔除回归方程中不显著交互项，简化后公式为：

表3 狮头柑果皮响应面试验回归模型方差分析Table 3 Anovariance analysis of regression model from peel of Shitougan

(3)

2.2.2 响应面和等高线图分析 由图5可知，超声功率为70 W时，三维面陡峭、等高线呈椭圆形，说明提取温度和提取时间的交互作用显著，狮头柑果皮总黄酮得率受到二者的共同影响。其中提取时间较提取温度的三维面陡，表明提取时间对狮头柑果皮总黄酮得率有极显著影响。

图5 提取温度和提取时间交互作用对总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of interaction of extraction temperature and extraction duration on yield of total flavonoids

由图6可知，提取时间为30 min时，三维面较陡、等高线呈椭圆形，表明提取温度和超声功率的交互作用显著，狮头柑果皮总黄酮得率受到二者的共同影响。其中提取温度较超声功率的三维面陡，说明提取温度对狮头柑果皮总黄酮得率有显著性影响。

图6 提取温度和超声功率交互作用对总黄酮得率的影响Fig.6 Effect of interaction of extraction temperature and ultrasound power on yield of total flavonoids

由图7可知，提取温度为55℃时，三维面陡峭、等高线呈椭圆形，说明提取时间和超声功率的交互作用显著，狮头柑果皮总黄酮得率受到二者的共同影响。其中提取时间较超声功率的三维面陡，说明提取时间对狮头柑果皮总黄酮得率有极显著影响。

图7 提取时间和超声功率交互作用对总黄酮得率的影响Fig.7 Effect of interaction of extraction duration and ultrasound power on yield of total flavonoids

2.2.3 狮头柑总黄酮提取参数的优化与模型验证 用Design-Expert 10.0.3.1对参数进一步优化，结果表明，提取温度60℃、提取时间32.673 min、超声功率70.726 W，总黄酮得率为2.273%。在试验过程中对响应面优化结果进行了多次重复出现相同结果，优化后结果低于单因素最大值，可能是由于试验中做响应面试验的原料是在单因素试验后放置了一段时间，从而导致的样品原料存在差异引起的。

综合分析后，将优化后参数修正为：料液比1∶35(g∶mL)、提取温度60℃、提取时间33 min、超声功率70 W，使用修正后参数进行试验验证，结果测得总黄酮得率为2.258%，与模型预测值相差较小，证明该模型可以用于分析及预测。

3 结论与讨论

本研究主要为狮头柑资源能更好的开发利用提供新思路，进一步探索狮头柑中总黄酮的提取工艺，避免资源的浪费，为狮头柑产业的发展提供新的方法，有利于增加狮头柑的附加值。但对提取后果皮残渣的利用还需进一步探索，可考虑果胶、多糖和挥发油以及β-胡萝卜素等有效成分的提取工艺研究，建立连续提取体系，对挥发油的利用可考虑羟丙基-β-环糊精包合工艺，对β-胡萝卜素的利用可考虑微胶囊包埋技术。虽对果皮总黄酮提取工艺做了优化，但对于所提取的总黄酮类型还不明确，需要进一步进行分离和鉴定。