7种木莲属植物抗寒性评价及其生理机制

黄一波, 汪结明, 李瑞雪, 向言词, 宋禹, 颜玲玉

7种木莲属植物抗寒性评价及其生理机制

黄一波, 汪结明*, 李瑞雪, 向言词, 宋禹, 颜玲玉

(湖南科技大学建筑与艺术设计学院，湖南 湘潭 411201)

为建立木莲属()植物的抗寒性综合评价体系，对7种木莲属植物扦插苗进行低温胁迫处理，测定叶片的抗寒性关键生理指标，拟合Logistic方程计算低温半致死温度，隶属函数法筛选抗寒性关键指标并综合评价。结果表明，7种木莲属植物的低温半致死温度依次为木莲<红花木莲<荷花木莲<巴东木莲<球果木莲<锥花木莲<粗枝木莲，且与相对电导率显著正相关。7种木莲属植物叶片的游离脯氨酸和可溶性蛋白含量及超氧化物酶、过氧化物酶活性均随温度降低呈先升后降的趋势, 而可溶性糖和丙二醛含量则不断增加、后趋于平稳。聚类分析结果表明7种木莲可分为3类，木莲和红花木莲抗寒性较强；荷花木莲、巴东木莲和球果木莲抗寒性中等；粗枝木莲和锥花木莲抗寒性较弱。

木莲属；低温胁迫；生理响应；抗寒性

木莲属()是木兰科(Magnoliaceae)中珍贵的城市园林景观绿化树种[1]，树姿婀娜，花香宜人，极具观赏性。因其喜温暖湿润气候，主要分布于我国热带和亚热带地区[2–3]，北方地区秋冬季节寒冷、干燥，落叶树种居多，景观萧瑟，园林绿化效果单一[4]。因此，筛选抗寒性较强的木莲属植物，研究耐寒相关生理指标，对提高木莲属植物耐寒性、改善我国北方地区冬季常绿树种缺乏、园林景观单调萧条的现状等具有重要意义。

由于影响抗寒性的因素较多，单一的生理指标无法全方位反映出植物抗寒性[5–6]，因此评价植物抗寒性不仅需要选择适宜的指标，更需要科学准确的评价方法。低温半致死温度(semi-lethal temperature of low temperature, LT50)和其他相关生理指标常用于抗寒性评价[7–8]。当前研究评价植物抗寒性常用的方法主要有隶属函数法、电导率法、聚类分析法等。其中隶属函数法能够全方位筛选出与抗寒性显著相关的关键指标，揭示不同植物间抗寒性差别，已广泛运用于木兰属()[9–10]、含笑属()[11–12]和苹果属()[13–14]等植物的抗寒性研究中。薛建辉等[15]认为可溶性糖含量、POD活性可以作为评价红花木莲抗寒性的重要指标。李刚[16]报道低温胁迫下红花木莲的丙二醛(MDA)和叶绿素含量及POD、SOD活性均发生显著变化。虽然已对木莲属植物的抗寒性开展了较多研究，但多关注于低温胁迫下部分生理指标的变化，对抗寒性的评价仅用单项指标来鉴定，因此难以全面、综合反映出木莲属植物的抗寒性[17]。

为解析木莲属植物的抗寒性及其生理机制，本研究以7种木莲属植物无性系盆栽苗为试验材料, 在低温胁迫下测定叶片相对电导率，拟合Logistic方程计算植物的LT50，对相关生理指标和半致死温度进行相关性分析，运用隶属函数法进行抗寒性评价, 以期建立科学的木莲属植物抗寒性综合评价体系。

1 材料和方法

1.1 材料和处理

2018年4月从湖南省长沙植物园选取母株树龄基本相同、长势相近的木莲()、红花木莲()、荷花木莲()、巴东木莲()、球果木莲()、锥花木莲()和粗枝木莲()共7种木莲属植物当年生侧枝进行扦插繁殖。2019年10月每种植物选取生长基本一致的扦插苗各54株移至花盆, 并置于湖南科技大学生物园温室中培养2周，温度26℃, 湿度70%，光强200mol/(m2·s), 光周期: 14 h光照/12 h黑暗。试验共设6个处理, 在人工低温气候箱进行5℃、0℃、–5℃、–10℃、–15℃和–20℃低温胁迫2 h[7]，以5℃为对照, 每处理3株, 3次重复。选取当年生侧枝的成熟叶片，测定电导率和相关生理指标。

1.2 方法

参照陈建勋等[18]方法测定叶片相对电导率(REC)。参照陈刚等[19]的方法测其他生理指标。MDA含量用硫代巴比妥酸法，游离脯氨酸(Pro)含量用酸性茚三酮法，SOD活性用氮蓝四唑光化还原法，POD活性用紫外吸收法，可溶性糖(SS)含量用蒽酮比色法，可溶性蛋白质(SP)含量用考马斯亮蓝G-250法, 重复3次, 取平均值。

1.3 数据处理和分析

参照朱海根等[20]的方法计算抗寒隶属函数值(H)。呈正相关的公式H(X)=(X-max)/(X-min); 呈负相关的公式H(X)=1-(X-max)/(X-min), 式中,X为指标测定值，min、max为指标的最小、最大值。参照王飞雪等[21]的方法, 依据拟合Logistic方程=K/(1+a-b)计算拐点温度，其中为相对电导率, K为电导率的饱和值(最大值为100),为胁迫温度, a、b为线性回归系数, 根据LT50=lna/b计算半致死温度。采用隶属函数法[22–23]综合评价7种木莲属植物抗寒性强弱。通过Excel 2019和SPSS 16.0进行方差分析、标准差分析和聚类分析等。

2 结果和分析

2.1 相对电导率和半致死温度

致死性伤害出现前植物往往会有弹性修复过程，当伤害超出植物忍受阈值时则发生不可逆变化。通过测量低温下7种木莲属叶片的相对电导率,根据拟合的Logistic方程计算半致死温度，可直接反映植物耐寒性。从图1可见，7树种的相对电导率(REC)总体随温度下降呈先下降后上升的“S”形曲线趋势。当温度大于LT50时，REC缓慢升高，低于LT50则迅速上升，这表明伴随温度的下降，叶片细胞膜受伤害程度加强，膜透性也陆续加大。低温胁迫下，锥花木莲的REC显著高于其余6树种。在5℃～–5℃下，除锥花木莲外，其余6树种的REC变化不显著(>0.05)。当温度低于–5℃时，锥花木莲、粗枝木莲的REC迅速上升，–10℃时，荷花木莲、球果木莲的REC也迅速升高且变化不显著(> 0.05)；–15℃时，红花木莲、巴东木莲和木莲的REC迅速上升，这说明LT50出现越晚其抗寒性越强。

从表1可见，7树种的拟合Logistic方程相关系数2均在0.8以上。其中木莲、荷花木莲、球果木莲、锥花木莲、粗枝木莲的REC与5℃～–20℃处理2 h的LT50间呈极显著正相关，红花木莲与巴东木莲则呈显著正相关性。7种木莲属植物的LT50为–17.02℃～–5.767℃，其中木莲和红花木莲的LT50低于–15℃，荷花木莲、巴东木莲和球果木莲为–15℃～–10℃，而锥花木莲和粗枝木莲分别为–9.242℃和–5.767℃；可见，LT50依次为木莲<红花木莲<荷花木莲<巴东木莲<球果木莲<锥花木莲<粗枝木莲。

图1 低温下7种木莲属植物叶片的相对电导率(REC)。柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

表1 7种木莲属植物叶片相对电导率的拟合方程和低温半致死温度(LT50)

2.2 可溶性蛋白质含量

从图2可见，5℃时，除粗枝木莲外其余6种植物叶片可溶性蛋白质(SP)含量变化不显著，且随温度下降呈先升后降的变化趋势。红花木莲与木莲的SP含量最大值出现在–15℃，荷花木莲、巴东木莲、球果木莲的均为–10℃，而粗枝木莲、锥花木莲在–5℃达最大。SP含量最大值依次为木莲>红花木莲>巴东木莲>荷花木莲>球果木莲>锥花木莲>粗枝木莲, 分别比5℃时增加76.07%、70.45%、65.36%、60.88%、57.05%、50.91%和45.91%，说明LT50越低SP含量达到峰值的时间越晚，SP含量上升幅度越高。SP含量最大值过后，LT50越低SP含量的降幅越大，到–20℃时，SP含量较最大值下降最多的是木莲，下降了3.01 mg/g，其次为红花木莲，下降了2.73 mg/g, 下降最少的是粗枝木莲，仅下降0.67 mg/g。

2.3 可溶性糖含量分析

从图3可见，随温度降低7种木莲属植物叶片的可溶性糖(SS)含量逐渐上升。5℃时，7种木莲属植物叶片的SS含量差异不显著(>0.05)，小于5℃木莲叶片的SS含量均最高，红花木莲次之，而粗枝木莲叶片的均最低。–20℃时叶片的SS含量依次为木莲>红花木莲>荷花木莲>巴东木莲>球果木莲>锥花木莲>粗枝木莲，分别比5℃时增加了450.87%、332.05%、270.12%、281.61%、235.34%、176.92%和179.15%。可见，低温下LT50越低叶片的SS含量积累越多。

图2 低温下7种木莲属植物叶片的可溶性蛋白质含量(SP)

2.4 游离脯氨酸含量

从图4可见，7种木莲属植物叶片游离脯氨酸(Pro)含量随温度的降低呈先升后降的变化趋势。木莲和红花木莲叶片的Pro含量最大值出现在–15℃，荷花木莲、巴东木莲、球果木莲的为–10℃，锥花木莲和粗枝木莲的为–5℃。7种木莲属植物叶片的Pro含量最大值依次为木莲>红花木莲>荷花木莲>巴东木莲>球果木莲>锥花木莲>粗枝木莲，最大值分别比5℃时增加了388.40%、355.39%、295.16%、327.06%、349.03%、174.98%和295.83%。此后，7种木莲属植物叶片的Pro含量均下降，但仍高于对照。–20℃时的Pro含量依次为木莲>红花木莲>荷花木莲>巴东木莲>球果木莲>锥花木莲>粗枝木莲。

图3 低温下7种木莲属植物叶片的可溶性糖含量(SS)

图4 低温下7种木莲属植物叶片的游离脯氨酸含量(Pro)

2.5 丙二醛含量

从图5可见，7种木莲属植物叶片的丙二醛(MDA)含量随温度降低总体呈先上升后下降的变化趋势。低温下，叶片的MDA含量与LT50呈正相关关系，其中粗枝木莲叶片的MDA含量与温度呈负相关关系，在–10℃后趋于稳定。5℃时7种木莲属植物MDA含量差异不显著(>0.05)，在5℃～–5℃时，除粗枝木莲外其余6树种叶片MDA含量缓慢上升，至–10℃时迅速增加，–15℃后趋于稳定。这表明低温胁迫下，LT50越高的木莲属植物细胞膜脂过氧化水平越高，积累更多的MDA。低温下叶片MDA含量依次为粗枝木莲>锥花木莲>球果木莲>巴东木莲>荷花木莲>红花木莲>木莲。

图5 低温下7种木莲属植物叶片的丙二醛含量(MDA)

2.6 超氧化物酶和过氧化物酶活性分析

从图6可见，7种木莲属植物叶片的过氧化物酶(POD)与超氧化物酶(SOD)活性在低温胁迫下的变化基本一致，均呈先升后降的趋势，接近LT50时叶片的POD和SOD活性显著下降(<0.05)。从5℃降至0℃，木莲和红花木莲叶片的POD和SOD活性显著降低(<0.05)；–5℃时木莲和红花木莲的显著上升(<0.05)，而荷花木莲、巴东木莲、球果木莲叶片仍保持较高活性，但锥花木莲、粗枝木莲显著下降(<0.05)；–10℃时，木莲和红花木莲叶片的SOD活性比5℃时分别提高了234.44%和180.02%，POD活性分别提高了722.81%和419.30%；在–20℃时，木莲叶片中的SOD活性较5℃时差异不显著(>0.05)，红花木莲、荷花木莲、巴东木莲、球果木莲、锥花木莲和粗枝木莲叶片中的SOD活性含量分别比5℃时下降了32.97%、72.59%、73.80%、84.31%、96.40%和98.26%；木莲和红花木莲叶片中的POD活性比5℃时增加了166.36%和9.11%, 荷花木莲、巴东木莲、球果木莲、锥花木莲和粗枝木莲叶片中的POD活性含量比5℃时显著降低(< 0.05)。

2.7 抗寒性评价

相关性分析与抗寒关键生理指标选择 相关性分析表明(表2), LT50与REC和MDA呈极显著正相关(<0.01)，与SP、SS和Pro极显著负相关(<0.01)，而与SOD和POD的相关性不高，故筛选出REC、SP、SS、Pro和MDA作为评估7种木莲属植物抗寒性的关键指标。REC的检测相对其他生理指标更便捷，可以根据LT50直观反映出抗寒性强弱，在实际应用中更广泛，SP、SS、PRO、MDA则需要根据低温胁迫下的含量变化来判断植物抗寒性强弱。

抗寒性评价和聚类分析 隶属函数法通常用来评价综合抗寒性，隶属函数值与抗寒性成正相关，隶属函数值越大抗寒性越强，反之抗寒性越弱。从表3可见，用隶属函数法计算REC、SP、SS、Pro、MDA等5个关键指标的隶属函数值，木莲的隶属函数值最大(0.736)，表明抗寒性最强，其次是红花木莲(0.621)，是粗枝木莲的最小(0.335)抗寒性最弱，木莲的平均隶属函数值是红花木莲的220%。7种木莲属植物的抗寒性依次为：木莲>红花木莲>荷花木莲>巴东木莲>球果木莲>锥花木莲>粗枝木莲。基于平均隶属函数值进行聚类法分析(图7)，结果表明，7 种木莲属植物的综合抗寒性可分为3类，木莲和红花木莲归为第1类，综合抗寒性强；荷花木莲、巴东木莲和球果木莲归为第2类，综合抗寒性中等；锥花木莲和粗枝木莲归为第3类，综合抗寒性弱，这和用相对电导率计算出的LT50结果相似。

图6 低温下7种木莲属植物叶片的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性

表2 7种木莲属植物生理指标相关性矩阵

*:<0.05; **:<0.01. LT50: 低温半致死温度; REC: 相对电导率; SP: 可溶性蛋白质; SS: 可溶性糖; Pro: 脯氨酸; MDA: 丙二醛; SOD: 超氧化物歧化酶; POD: 过氧化物酶。下表同。

*:<0.05; **:<0.01. LT50: Semi-lethal temperature of low temperature; REC: Relative electrical conductivity; SP: Soluble protein; SS: Soluble sugar; Pro: Proline; MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase; POD: Peroxidase. The same is following Table.

表3 　7种木莲属植物抗寒性整体评价

3 结论和讨论

细胞膜系统是植物受低温伤害的原发部位，植物受到低温胁迫时，胞内电解质渗出，电导率增大[24]。因此，REC可用于鉴定细胞及膜系统受损伤的程度[25–26]。低温胁迫下，7树种的REC总体随温度下降呈先下降后上升的“S”形曲线趋势，说明低温处理对细胞膜造成伤害，胞内电解质渗出，这与前人[27–29]的研究结果一致。锥花木莲、粗枝木莲和荷花木莲、球果木莲以及红花木莲、巴东木莲、木莲分别在–5℃、–10℃、–15℃时电导率迅速上升, 说明膜脂物相已由液晶相变为凝胶相、膜系统被破坏程度严重。LT50反映了植物抗寒性强弱和耐低温极限，LT50越低植物抗寒性越强[30–31]。本研究结果表明，红花木莲和木莲的LT50分别为–15.23℃和–17.02℃, 有研究表明红花木莲抗寒性较强，LT50约为–10℃[15–16]。而苏敬[32]却认为红花木莲的LT50约为–5℃，这可能与试材年龄和区域有关。

图7 　7种木莲属植物抗寒性的聚类分析。1: 木莲; 2: 红花木莲; 3: 荷花木莲; 4: 巴东木莲; 5: 球果木莲; 6: 锥花木莲; 7: 粗枝木莲。

植物通过渗透调节物质来调节体内细胞液浓度、降低胞内渗透势，增加抗寒性能力[33–34]。可溶性糖(SS)、脯氨酸(Pro)和可溶性蛋白(SP)是细胞的主要渗透调节物质，在低温胁迫下可通过调节渗透物质的含量来缓解低温伤害，渗透物质含量可以反映植物抗寒性[35–36]。低温处理下, 7种木莲属植物的Pro和SP含量呈先升后降的变化趋势, 而SS含量不断增加并趋于平稳，LT50最低的木莲在不同低温下Pro、SP、SS含量均为最高，抗寒性也最强，而LT50最高的粗枝木莲均为最低，抗寒性最弱，这表明LT50越低的树种，渗透调节物质积累的最多，抗寒性越强，这与前人[37–38]对广玉兰()的研究结论相似。

低温胁迫下，植物细胞往往会发生脂膜过氧化，丙二醛(MDA)作为脂膜过氧化的最终产物之一，其含量可以反映细胞膜系统在低温胁迫下的受伤害程度[25]。随温度下降，7种木莲属植物叶片的MDA含量总体上不断升高，达峰值后，由于细胞冻伤死亡，逐渐平缓。LT50最高的粗枝木莲叶片的MDA含量始终保持最高水平，抗寒性弱，而LT50最低的木莲叶片始终保持最低水平，抗寒性强，表明低温迫胁下木莲膜脂过氧化，细胞膜系统受伤程度低，这与前人[14,39]的研究结果一致。SOD和POD是植物体内清除H2O2和自由基的重要抗氧化酶[40–41],本研究结果表明，随温度的下降，7种木莲属植物叶片SOD和POD活性皆呈现出先升后降的趋势。在5℃和0℃下，木莲和红花木莲叶片的SOD和POD活性远低于其余5种木莲属植物，说明其具备抵制寒冷伤害的能力。随温度的下降，植物体内的脂膜过氧化程度加剧，锥花木莲、粗枝木莲和荷花木莲、球果木莲、巴东木莲的SOD和POD活性分别在0℃和-5℃时达最大，而木莲和红花木莲叶片的SOD和POD活性迅速上升，在-10℃达最大, 这表明木莲和红花木莲抗寒性最强。-10℃后木莲、红花木莲的SOD和POD活性皆下降，这可能是保护酶系统遭到破坏, 致使植物体内清除活性氧自由基作用降低，不能缓解低温胁迫带来的伤害。

木莲属植物种类繁多，种间差异不明显，导致分类较为困难，因此关于木莲属植物的分类研究常成为热点。本研究从抗寒性进行聚类分析，结果表明，木莲和红花木莲属于抗寒性较强的一类，而荷花木莲、巴东木莲和球果木莲属于抗寒性中等的一类，锥花木莲、粗枝木莲则属于抗寒性较弱的一类，这从抗寒性上为木莲属植物提供了新的分类依据。孟爱平等[42]对巴东木莲、红花木莲的核型分析结果不支持两者归为一类；肖黎等[43]的研究将木莲、红花木莲归为一类，巴东木莲分为另一类，这与本研究结果一致。而桑子阳等[44]的研究将木莲、红花木莲和巴东木莲归为一类，这与本研究结果不同，可能是由于研究的物种与数量不同所致。

本研究基于隶属函数法筛选出REC、SP、SS、Pro、MDA等5个木莲属植物的抗寒性关键评价指标。基于隶属函数值的聚类分析法能快速区分抗寒性植物种类，为抗寒性植物的初步筛选提供了有效途径，同时从抗寒性分类角度为植物的传统分类方法提供了新的思路。此外，筛选出的抗寒性强的植物对于南树北移、丰富北方园林植物景观具有重要实践价值。

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Evaluation of Cold Resistance and Physiological Mechanism of SevenSpecies

Huang Yibo, Wang Jieming*, Li Ruixue, Xiang Yanci, Song Yu, Yan Lingyu

(School of Architecture and Art Design, Hunan University of Science and Technology,Xiangtan 411201, Hunan, China)

In order to establish a comprehensive evaluation system for cold resistance ofspecies, the key physiological indexes of cold tolerance in seven cutting seeding were determined under low temperature. The fitting logistic equation was used to calculate the semi-lethal temperature of low temperature (LT50), and the key indexes of cold resistance were screened and evaluated by membership function method. The results showed that the LT50of sevenspecies were in the order of<<<<<<,which had positively significant correlation with relative conductivity. With the temperature decrease, the contents of free proline and soluble protein, activities of superoxide dismutase and superoxide dismutase in sevenspecies fall after rising, while contents of soluble sugar and malondialdehyde increasing and gradually leveling off. The cluster analysis showed that 7species could be divided into 3 groups, cold resistance ofandstronger,,andwere medium,andwere weak.

; Low temperature stress; Physiological response; Cold resistance

10.11926/jtsb.4349

2020-12-03

2021-03-01

国家自然科学基金项目(31671628)；湖南省自然科学基金项目(2020JJ6025, 2020JJ4294)资助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31671628); and the Natural Science Foundation of Hunan (Grant No. 2020JJ6025, 2020JJ4294).

黄一波(1994～ )，男，硕士研究生，研究方向为植物景观。E-mail: 1246282053@qq.com

. E-mail: 364482609@qq.com