添加中草药对发酵TMR化学成分、微生物组成及发酵品质的影响

■王 妍 江 迪 李荣荣 郑猛虎 崔欣雨 徐春城

（中国农业大学工学院，北京 100083）

发酵TMR，是根据家畜不同生产阶段的营养需要和饲料原料的营养价值，设计科学合理的日粮配方，采用高密度成型、拉伸膜裹包技术，经过乳酸菌（LAB）发酵调制而成的一种营养平衡的日粮[1]。发酵TMR不仅能够有效保存TMR的营养价值，而且，通过发酵产生的生物活性物质还可以增加其附加价值，发酵还提高了TMR 的贮藏性和有氧稳定性，便于工业化生产和商品化流通。

中草药源于自然，是一种可以用来替代化学类饲料添加剂的天然药物[2]。中草药中存在许多有效成分，如类黄酮、多糖等[3]，这些活性成分可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等多种致病菌的生长[4]。李鼎等[5]研究发现，黄芩对无乳链球菌有较好的抑菌效果，当归和茯苓对LAB有促进作用[6]。也有研究表明，在反刍动物饲料中添加中草药，不仅可以改善饲料适口性，促进采食量，而且对动物生长性能、机体免疫力、产奶性能和改善热应激等都有积极作用[7-10]。Ni 等[11]将黄芪渣和山楂渣添加在苜蓿中青贮，提高了青贮饲料的发酵品质。蒋苏苏等[12]将中药渣添加到全株玉米中青贮，发现添加5%党参对青贮品质改善效果较好。然而，目前为止中草药应用于发酵TMR的相关研究还未见报道。因此，本研究旨在探讨添加当归、黄芩、茯苓三种中草药对TMR化学成分、微生物组成以及发酵品质的影响，为中草药作为发酵TMR的添加剂提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苜蓿干草来源于北京市农林科学院北京草地与环境研究发展中心，由第二茬紫花苜蓿晾晒而得。豆浆渣取自中国农业大学学生食堂。中草药购自北京同仁堂。

1.2 试验设计

将苜蓿干草、玉米粉、新鲜豆浆渣、豆粕、预混料、食盐按照DM 36∶25.5∶21∶12∶5∶0.5的比例混合调制TMR。设置4个处理组，分别添加2%的无菌水（T1）、2%的当归（T2）、2%的黄芩（T3）、2%的茯苓（T4）。其中，T1组作为对照组。每个处理设置3个重复。

1.3 中草药添加剂的制作与处理

中草药各取10 g 加入100 mL 纯化水，放入4 ℃冰箱浸提24 h。以文火煮沸30 min，过滤后继续加100 mL纯化水，文火煮沸30 min后，再次过滤。将两次过滤后药液混合，再在文火上浓缩至10 mL，即为100%中草药原液，灭菌后放入4 ℃冰箱备用[13]。每种中草药各制备100 mL原液。

1.4 发酵TMR调制

根据配方与试验设计，将原料与中草药添加剂充分混合均匀，取300 g装入青贮袋内，用真空包装机抽真空并封口。每个处理3 个重复。室温条件下发酵0、7、14、28、56 d后开封。

1.5 化学成分、微生物组成及发酵品质分析

1.5.1 化学成分

每袋发酵TMR样品开封后，充分混匀，称取样品约150 g，65 ℃鼓风干燥箱烘干48 h，并粉碎过1 mm筛装入自封袋，制得干样。DM采用烘干法，粗蛋白质（CP）采用凯式定氮法，中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）采用范式纤维法[14]，可溶性碳水化合物（WSC）采用蒽酮-硫酸比色法[15]测定。

1.5.2 微生物计数

每袋发酵TMR样品开封后，将样品充分混匀，准确称取10 g样品装入无菌自封袋中，加入90 mL无菌去离子水，用均质器处理3 min 后放入4 ℃冰箱浸提2 h，制得浸提液。浸提液一部分进行微生物计数。好氧细菌（AB）采用NA培养基（Nissui，日本），30 ℃恒温培养箱培养48 h计数。LAB采用MRS培养基（Dif⁃co，美国），37 ℃厌氧培养箱培养48 h 计数。酵母菌（Yeast）采用PDA 培养基（Nissui，日本），30 ℃恒温培养箱培养48 h计数。

1.5.3 发酵品质

浸提液的另一部分用4层纱布过滤，再用定性滤纸进行二次过滤，用于测定pH和NH3-N。pH采用pH计测定。NH3-N 采用苯酚-次氯酸钠比色法[16]测定。取适量的二次过滤后的浸提液，加入少量阳离子交换树脂（Amber lite，Tokyo，Japan）充分振荡，6 000 r/min离心5 min，用0.22 μm 水相微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱法（色谱柱：Shodex Rspak KC-811 Col⁃umn Shimadzu，日本；检测器：SPD-M10AVP；流动相：3 mmol/L高氯酸；流速：1 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：5 μL；柱温：50 ℃）测定LA、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）含量。

1.6 数据分析

微生物组成、发酵品质及化学成分采用Excel 2019进行数据整理，所有数据采用IBM SPSS Statistics for Windows 21软件进行分析，利用一般线性模型进行二因素方差分析（two-way ANOVA），并用Tukey法多重比较检验差异的显著性。显著性水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 TMR发酵过程中微生物组成的动态变化（见表1）

表1 TMR微生物组成的动态变化

不同处理、发酵时间以及二者间的交互作用对AB、LAB 有显著影响（P<0.05）。发酵前，原料中AB、LAB、Yeast的微生物数量分别为107、106～107CFU/g FM和103～104CFU/g FM。发酵7 d时，AB数量达到峰值；随着发酵时间的延长，数量持续下降，56 d时，AB数量降低到103CFU/g FM，极显著低于其他时间（P<0.01）。LAB的数量始终在较高的水平，发酵56 d的LAB数量为108CFU/g FM。发酵7 d后Yeast的数量下降至检测限以下。发酵7、14 d时，T2组AB数量显著低于对照组（P<0.05），LAB数量显著高于对照组（P<0.05）。

2.2 TMR发酵过程中发酵品质的动态变化（见表2）

表2 TMR发酵品质的动态变化

不同处理、发酵时间以及二者间的交互作用对pH有极显著影响（P<0.01）。不同处理及发酵时间对LA、AA、PA 和NH3-N 含量有极显著影响（P<0.01）。随着发酵时间的延长，各组发酵TMR 的pH极显著下降（P<0.01），LA、AA、PA 和NH3-N 含量极显著升高（P<0.01），未检出BA。其中，所有组别的pH 在发酵前7 d 迅速降低、LA 含量则迅速升高，之后二者均呈缓慢变化趋势。发酵56 d时，各组pH降到4.6以下，LA含量达到7.31% DM～8.30% DM。NH3-N占总氮的比例始终保持在4%以下。T2组在7、14、28、56 d的pH，14、56 d的PA含量和7、14、56 d的NH3-N含量显著低于对照组（P<0.05），在14、28、56 d的LA含量显著高于对照组（P<0.05）。T3组在0、7、56 d的pH显著低于对照组（P<0.05），在28、56 d的LA含量和56 d的PA含量显著高于对照组（P<0.05）。T4 组在7、14、28、56 d 的pH 显著低于对照组（P<0.05），在28、56 d 的LA 含量和56 d的PA含量显著高于对照组（P<0.05）。

2.3 TMR发酵过程中化学组成的动态变化（见表3）

表3 TMR发酵过程中化学成分的动态变化

不同处理、发酵时间以及二者的交互作用对WSC含量有极显著影响（P<0.01）。发酵时间极显著影响DM含量（P<0.01）、显著影响CP含量（P<0.05）。随着发酵时间的延长，各组WSC含量极显著降低（P<0.01），特别是发酵前7 d，各组WSC含量迅速降低；DM含量极显著下降（P<0.01）、CP 含量显著升高（P<0.05）；NDF、ADF含量无显著性差异（P>0.05）。其中，T2组在7、14、28、56 d的WSC含量显著低于对照组（P<0.05），T3组在7、56 d的WSC含量显著低于对照组（P<0.05）。

3 讨论

3.1 添加中草药对TMR微生物组成的影响

LAB在青贮及发酵TMR过程中起着重要的作用，在发酵前14 d，LAB大量增殖，达到108～109CFU/g FM，随后数量有所下降，最终数量维持在108CFU/g FM，是整个发酵过程中的主要微生物。AB 初始数量为107CFU/g FM，发酵14 d 后被抑制，最终达到103CFU/g FM。Yeast 在发酵7 d 后处于检测限以下。一方面，中草药可以促进LAB发酵产生LA，使得pH降低，从而抑制不良微生物的生长。另一方面，中草药中含有一些活性成分，对不良微生物也有一定的抑制作用。Ni等[11]研究表明，中草药在青贮过程中能够抑制梭菌、肠杆菌和真菌的生长。邢冬梅等[17]研究表明，当归挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等均有一定的抑制作用。刘芳等[18]研究表明，当归总黄酮提取液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有抑制作用，且抑菌效果明显。本试验中，发酵7、14 d 时，T2 组AB 数量低于对照组，LAB 数量高于对照组，说明添加当归能够有效促进LAB 发酵并抑制好氧微生物的繁殖。但黄芩和茯苓在本试验中并没有表现出明显的抑菌效果。李慧[19]研究发现，大部分茯苓多糖的生物活性利用率极低。印遇龙等[20]报道，中草药的传统提取条件难以将其有效成分完全利用。因此，有效成分的低利用率和低提取率可能是黄芩和茯苓在本试验中没有表现出显著性差异的原因。

3.2 添加中草药对TMR发酵品质的影响

本试验中，各组TMR均具有良好的发酵品质，具体表现为较低pH（4.56）、NH3-N 含量（3.13% TN）和较高LA 含量（8.30% DM）。TMR 发酵前的pH 为6.34～6.58，根据预试验结果可知，当归、黄芩和茯苓的提取液pH均小于7，偏酸性，因此发酵前处理组的pH低于对照组。发酵7 d 时，各组pH 迅速下降，达到4.84～5.02，随着发酵时间的延长，pH 缓慢下降，最终降至4.6以下。这与Tian等[21]研究结果相一致。有机酸含量是评价TMR 发酵品质的重要指标，其中LA含量直接影响着发酵品质的好坏。NH3-N 的积累通常被认为是蛋白质和氨基酸降解的指标[22]。BA 来源于梭菌的活动[23-24]。经过56 d 发酵，各组TMR 的LA 含量达到8% DM，NH3-N占总氮的比例均在4%以下，各组均未检出BA。这些结果均表明TMR发酵良好。

陆银[25]在苜蓿中添加黄芪和山楂进行青贮发现，添加中草药的青贮饲料具有更低的pH、NH3-N 含量以及更高的LA含量。本试验中，添加当归、黄芩和茯苓也获得了同样的结果，发酵56 d后，与对照组相比，T2、T3 和T4 组的pH 显著降低，LA 含量显著升高，表明添加中草药可以有效改善TMR的发酵品质。值得注意的是，T2组pH最低，LA含量最高，且NH3-N含量低于其他组，发酵品质最好，这可能是当归中的当归多糖及黄酮类物质抑制了有害微生物繁殖[18]，促进了LAB 生长[6]，从而产生了大量LA、显著降低pH，减少了TMR 中蛋白质的降解，显著降低了NH3-N 含量。这也与杨富裕等[26]报道的添加黄芩和当归可有效改善青贮饲料的发酵品质，且添加0.5%的当归可以显著降低NH3-N含量的结果相一致。

4 结论

添加当归、黄芩和茯苓均能显著促进LAB 发酵，提高LA含量，降低TMR的pH，有效改善TMR的发酵品质。其中，当归处理组的pH 和NH3-N 含量最低，LA含量最高，其作用效果最好。