线粒体分裂抑制剂1对胶原诱导性关节炎小鼠疾病进展的抑制作用和机制

王晓艳 陈祝锋 方瑜 周瑞 高飞

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎为主要病理表现的自身免疫性炎症性疾病，滑膜局部表现为CD4+T淋巴细胞大量浸润。研究发现滑膜局部调节性 T 细胞（regulatory T cells，Tregs）/Th17的失衡与RA疾病发生密切相关，通过调节两者表达可达到缓解疾病的目的[1]。线粒体分裂抑制剂1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）通过抑制线粒体动力相关蛋白 1（dynamin-related protein 1，DRP1）的三磷酸鸟苷酶活性，抑制线粒体分裂，达到治疗多种疾病的目的[2]。Li等[3]报道，Mdivi-1可通过抑制Th1/Th17细胞，促进Tregs的表达，抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎的疾病进展。本研究通过动物实验来探讨Mdivi-1是否可通过调节滑膜局部Tregs及Th17细胞的表达来抑制胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）的进展，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物和材料 7周龄雄性SPF级DBA/1小鼠16只，体重18～20 g，购自北京维通利华公司。Ⅱ型胶原（美国Chondrex公司，批号：20022）；弗氏不完全佐剂（美国Chondrex公司，批号：7002）；弗氏完全佐剂（美国Sigma公司，批号：F5881）；二甲基亚砜（dihydroethidium，DMSO）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：ST038）；Mdivi-1（美国 Sigma 公司，批号：M0199）；兔源IL-10多克隆抗体、兔源IL-17多克隆抗体、兔源叉头状转录因子（forkhead box protein 3，Foxp3）多克隆抗体、HRP标记山羊抗兔（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号依次为：GB11108、GB11110、GB11093、GB23303）。本实验经陕西中医药大学伦理委员会审批通过。

1.2 CIA小鼠模型构建及治疗 取相同体积Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂，冰上乳化15～20 min，待滴在水面不扩散即可，放置冰盒中备用。将小鼠固定，露出尾部，消毒，在距尾根部2 cm处皮下注射100 μl上述乳化剂。第21天，取相同体积Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂，冰上乳化15～20 min，在距尾跟部3 cm处皮下注射100 μl。第28天，小鼠CIA模型构建成功，采用随机数字表法分为DMSO组和Mdivi-1组，每组8只。隔日给予药物干预，DMSO组给予1%DMSO（DMSO∶0.9%氯化钠注射液=1∶100 稀释）腹腔注射，0.5 ml/只；Mdivi-1 组给予Mdivi-1（0.2 mg Mdivi-1溶于5 μl DMSO中，然后用0.9%氯化钠注射液稀释100倍）腹腔注射，0.5 ml/只；均持续10 d。

1.3 关节炎评分 第21天后，小鼠陆续出现关节炎表现。从第28～37天，每日分别对每只小鼠的4个爪进行1次关节炎评分，评分标准如下：0分：正常；1分：单个关节轻度红肿；2分：爪背、关节中度红肿；3分：爪背、关节重度红肿；4分：多个关节重度红肿，伴有严重创伤。最高16分。两位观察者进行双盲评分，取两者平均值。

1.4 滑膜组织病理学检测 第38天脱颈椎处死小鼠，解剖小鼠的膝、踝关节，置于10%多聚甲醛中固定。常规石蜡包埋，4 μm切片，脱蜡至水，然后蒸馏水洗。HE染色，脱水封片，显微镜下拍照分析。

1.5 滑膜组织免疫组化检测 常规石蜡包埋切片后，脱蜡至水，然后蒸馏水洗；依次进行抗原修复、灭活、一抗孵育（IL-10 1∶300，IL-17 1∶800，Foxp3 1∶300，用 PBS稀释）、二抗孵育（1∶200）、DAB 显色、复染返蓝、脱水封片，最后进行显微镜下观察并拍照分析，统计分析每组至少3个视野下阳性细胞数目百分比。

2 结果

2.1 两组小鼠关节炎评分比较 Mdivi-1组小鼠第31、33、34、35、36、37 天关节炎评分均低于 DMSO 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。Mdivi-1组关节炎症状较DMSO组明显减轻，见图1（插页）。

表1 两组小鼠关节炎评分比较（分）

图1 两组小鼠关节炎表现[a：二甲基亚砜（DMSO）组；b：线粒体分裂抑制剂 1（Mdivi-1）组]

2.2 两组小鼠膝、踝关节滑膜组织病理学变化比较Mdivi-1组小鼠膝、踝关节滑膜组织炎症细胞浸润程度较DMSO组明显减轻，见图2（插页）。

2.3 两组小鼠膝、踝关节滑膜组织阳性细胞数目百分比比较 Mdivi-1组小鼠膝、踝关节滑膜组织Foxp3、IL-10的阳性细胞数目百分比均高于DMSO组，IL-17的阳性细胞数目百分比低于DMSO组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。两组小鼠膝、踝关节滑膜组织免疫组化染色见图3（插页）。

图3 两组小鼠膝、踝关节滑膜组织免疫组化染色所见[a：二甲基亚砜（DMSO）组小鼠IL-10的表达；b：线粒体分裂抑制剂1（Mdivi-1）组小鼠IL-10的表达；c：DMSO组小鼠叉头状转录因子（Foxp3）的表达；d：Mdivi-1组小鼠Foxp3的表达；e：DMSO组小鼠IL-17的表达；f：Mdivi-1 组小鼠 IL-17 的表达；×20]

表2 两组小鼠膝、踝关节滑膜组织阳性细胞数目百分比比较（%）

3 讨论

RA是一种主要以关节滑膜炎为主要表现的自身免疫炎症性疾病，RA关节滑膜组织中CD4+T淋巴细胞大量浸润，提示RA是T细胞介导的免疫反应异常性疾病。CD4+T淋巴细胞由促进免疫应答的Th细胞和调节这些免疫应答的Tregs细胞组成。Th细胞因其分泌细胞因子的不同分为Th1、Th2、Th17细胞亚群。在RA滑膜组织中，Th1、Th17的表达明显升高，通过分泌TNF-α、IL-17等炎症因子加重滑膜炎，Tregs是CD4+CD25+Foxp3+的T细胞，通过分泌IL-10、细胞毒性 T淋巴细胞相关蛋白4等细胞因子抑制免疫反应[4-6]。众所周知，通过调节局部Th1/Th17/Tregs的表达可达到缓解RA滑膜炎症的目的。

研究指出，RA滑膜局部存在线粒体功能异常，表现为线粒体分裂增加，活性氧表达增加，线粒体氧化呼吸链复合体4的缺陷以及线粒体自噬增加等[7-10]。Mdivi-1是线粒体分裂抑制剂，能够明显抑制线粒体动力相关蛋白1的三磷酸鸟苷酶活性，并呈剂量依赖性下降[11]，从而抑制线粒体分裂。笔者前期研究指出，与对照组相比，RA患者滑膜组织中线粒体分裂明显增加，对RA患者的滑膜成纤维细胞给予Mdivi-1干预后，可通过抑制蛋白激酶（protein kinase B，Akt）/IB 激酶（nuclear factor B kinase，IKK）/NF-κB 信号通路，降低细胞中炎症性细胞因子环氧化酶-2及IL-8的表达，从而抑制细胞增殖及炎症反应[12]。然而Mdivi-1是否会对CIA滑膜局部Th17/Tregs的表达产生影响，从而影响疾病进展，本课题进行了进一步的研究发现，在第28天对两组CIA小鼠给予Mdivi-1治疗后，与DMSO组相比，Mdivi-1组第31天起小鼠关节炎即明显减轻，并逐渐明显，同时滑膜组织病理显示滑膜炎症明显减轻，提示Mdivi-1能够有效减轻CIA小鼠滑膜炎症的进展，改善关节炎。那么滑膜局部CD4+T淋巴细胞的表达有何变化呢？结果显示，在应用Mdivi-1治疗10 d后，第38天处死小鼠，检测滑膜局部细胞因子发现：IL-17表达明显下降，提示Mdivi-1可抑制滑膜局部Th17细胞的表达，抑制局部免疫炎症反应，同时IL-10、Foxp3表达增加，由于Tregs细胞表面Foxp3阳性，提示Mdivi-1可能同时通过促进Tregs的表达，促进抗炎症细胞因子的释放，从而缓解CIA小鼠的疾病进展。然而，Mdivi-1对各型Th细胞转录因子的影响，及其能否通过调节外周血及淋巴细胞中CD4+T细胞分化，从而调节CIA小鼠全身免疫反应，仍需课题组后续研究进一步明确。

综上所述，本研究采用CIA小鼠模型，观察Mdivi-1对小鼠关节炎疾病进展及炎症的影响。结果表明，Mdivi-1可能通过抑制关节滑膜局部Th17的表达，促进Tregs的表达，抑制CIA小鼠滑膜炎症的进展，为RA的治疗提供了新的方向。