缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和双肾上腺皮质激素样激酶1（DCLK1）在结直肠癌组织中的表达及临床意义

潘燕芳，李秋云，赵旁益，姜海雅

（广西柳州钢铁集团有限公司医院，广西柳州 545002）

直肠癌好发于老年人群，在我国平均每十万人中有10.1 人因结直肠癌而死亡，临床上对于结直肠癌的诊治提倡早发现、早确诊、早治疗，以增加患者生存几率、提升其生活质量[1]。目前，主要筛查与诊断方式包括结肠镜、血液肿瘤标志物检测、计算机断层摄影仿真肠镜等[2]。早期直肠癌患者通过手术治疗可以痊愈，但是当患者出现临床症状时，病变往往已经是进展期。随着医疗技术创新，肿瘤标志物检测因操作简单、痛苦小等优越性而容易被患者接受，因而检测肿瘤标志物成为确定诊断、指导治疗恶性肿瘤的重要工作之一[3]。HIF-1α 是缺氧状态下细胞分泌的核蛋白，与相关靶基因结合后可促进肿瘤组织中血管新生[4]；DCLK1 作为肿瘤干细胞的一种生物标志，在肿瘤发生发展中起着重要作用[5]，其表达上调可参与肿瘤发生过程并能改变肿瘤细胞对化疗的敏感性[6-7]。然而，上述两种蛋白质与结直肠癌发生发展的相关性仍未明确。因此，本研究通过回顾性分析100 例结直肠癌患者的临床资料，观察HIF-1α 和DCLK1 两种生物标志物在结直肠癌组织中的表达情况及两者的关系，并研究其与肿瘤相关临床特征的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年2 月至2019 年7 月广西柳州钢铁集团有限公司医院收治的100 例结直肠癌患者的临床资料进行回顾性分析。男性50 例，女性50 例；年龄38～71 岁，平均（47.35±9.16）岁；肿瘤分化程度（TNM 分期）：高、中、低分别为18、51、31 例。纳入标准：①符合结直肠癌[8]的临床诊断；②病理学、分子生物学等资料均完整。排除标准：①HIF-1α、DCLK1 检测结果不明确、无法判定结果者；③合并重要器官功能障碍者；④入院前曾接受过放射治疗、化学治疗等治疗方法（诊断性手术除外）者。本研究经由广西柳州钢铁集团有限公司医院医学伦理委员会审批。

1.2 方法 所有患者均经手术获得病理标本并被明确诊断为结直肠癌，收集其结直肠癌组织标本，应用免疫组化技术予以HIF-1α、DCLK1 检验。检验过程如下：取结直肠癌组织石蜡切片4 μm（赛默飞HM3555型切片机），70 ℃烤片2 h（湖北康强TKD-KP 型烤片机），按照LEICA BOND-MAX 规范流程上机染色，EnVision 两步法，一抗孵育时间20 min，封片。DCLK1 购自福州迈新生物技术开发有限公司，HIF1a购自北京中杉金桥生物技术有限公司。两种蛋白的表达量均采用免疫组化法（即链霉菌亲和素-过氧化物酶法）测定。

1.3 观察指标 ①HIF-1α/DCLK1 阳性率：按结直肠癌组织石蜡切片染色结果判定标准，在各切片随机选择高表达视野5 个，各视野计瘤细胞100 个，HIF-1α、DCLK1 蛋白表达阳性细胞数量（n）＜10%为阴性，10%≤n ＜50%为阳性，50%≤n ＜75%为强阳性，n ≥75%判断为极强阳性。阳性率为结果被判定为阳性、强阳性及极强阳性例数占总例数之比。②不同临床特征的HIF-1α 及DCLK1 阳性率：肿瘤直径、肿瘤肠壁侵袭程度、淋巴结转移情况、不同肿瘤分化程度及TNM分期下，HIF-1α 及DCLK1 阳性率的差异。③通过在光学显微镜下对组织切片观察，分别按染色程度（0～3 分，分别对应阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围（1～4 分，分别对应 0%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%）对患者的结直肠癌组织HIF-1α/DCLK1 蛋白表达量进行评分。

1.4 统计学分析 采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计数资料用[例（%）]表示，非等级资料行χ2检验，等级资料行Wilcoxon 秩和检验。HIF-1α、DCLK1 表达之间的关系及两者与临床病理特征之间的关系行Pearsonχ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α/DCLK1 阳性率 患者HIF-1α、DCLK1 表达阳性率分别为62%（62/100）、43%（43/100）。镜下观见图1、图2。

图1 HIF-1α 阳性（×100 EnVision 两步法）

图2 DCLK1 阳性（×100 EnVision 两步法）

2.2 不同临床特征下HIF-1α、DCLK1 阳性率比较 不同肿瘤直径的结直肠癌患者，其HIF-1α 及DCLK1 阳性率的差异无统计学意义（P ＞0.05）。肿瘤肠壁侵袭程度深、发生淋巴结转移、肿瘤分化程度更低、TNM 分期更低的患者，HIF-1α 阳性率更高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。同样，肿瘤肠壁侵袭程度深、发生淋巴结转移、肿瘤分化程度更低、TNM 分期更低的患者，DCLK1 阳性率更高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。这说明HIF-1α、DCLK1 的表达可能与肿瘤直径、肿瘤肠壁侵袭、淋巴结转移、肿瘤分化及TNM 分期之间存在一定关联，见表2。

表2 结直肠癌患者不同临床特征下HIF-1α、DCLK1 表达率比较（n=100）

2.3 HIF-1α 联合DCLK1 检测在结直肠癌组织表达相互关系 Pearson 相关性分析结果显示，结直肠癌组织中HIF-1α 与DCLK1 表达量评分呈正相关（r=0.572，P=0.029），见图3。

图3 患者结直肠癌组织 HIF-1α 与DCLK1 表达量评分的关系

3 讨论

据不完全统计结果显示，我国结直肠癌患者已经占据大肠疾病70%左右，主要累及直肠与乙状结肠交界处，是临床消化系统发生率较高的恶性疾病、致死率较高[9]。该病早期无显著临床特征，出现腹痛等症状多为进展期病变，因此，提前预防、及时治疗十分重要。

有研究证实，正常结直肠组织出现严重缺血缺氧时，HIF-1α 的表达量增加，通过活化Notch 信号通路（该信号转导途径参与调节肠发育和肠上皮更新）等途径促进直肠癌细胞发展[10]。

有研究表明，HIF-1α 在结肠癌的晚期、淋巴结转移的患者肿瘤细胞中HIF-1α 表达水平要高于早期及未发生淋巴结转移者[11]。HIF-1α 能够以调节多个靶基因的方式，帮助肿瘤细胞适应缺氧环境，且HIF-1α 在恶性肿瘤组织中存在高表达情况，提示HIF-1α 蛋白与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移存在相关性[12-13]。DCLK1 为肿瘤干细胞的生物标志物之一，有研究表明，癌细胞内DCLK1 表达被抑制后，可使肿瘤细胞的成瘤性显著下降[14]，这说明DCLK1 和结直肠癌的产生有关。本研究结果显示，HIF-1α、DCLK1 阳性率分别为62%、43%，分别与吴晨晨等[15]、乐安君等[16]报道的阳性率相似。肿瘤肠壁侵袭程度深、发生淋巴结转移、肿瘤分化程度更低、TNM 分期更低的患者，HIF-1α 阳性率更高（均P ＜0.05），DCLK1 阳性率也更高（均P ＜0.05）。这分别与吴晨晨[15]、孟存英[17]的研究结果相符，表明两者的阳性表达可能反映了直肠癌的恶化程度。本研究结果还表明，结直肠癌组织中HIF-1α 与DCLK1 表达呈正相关，这说明两者均与结直肠癌的进展有关。

综上所述，HIF-1α 和合DCLK1 在结直肠癌疾病检测中阳性率较高，与肿瘤分期晚、淋巴结转移等反映肿瘤恶化的临床特征有关，且HIF-1α 与DCLK1 在结直肠癌组织中呈正关性，推测两者均对结直肠癌的进展有推动作用。