电针不同腧穴对功能性便秘小鼠结肠组织脑源性神经营养因子和乙酰胆碱转移酶表达的影响

陈纪平，方亚飞，李彤中，梁超

1.邯郸市中医院，河北 邯郸 056001；2.河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056001；3.河北工程大学医学院，河北 邯郸 056038

随着人们生活习惯和饮食的改变，便秘日渐成为影响生活质量的重要因素[1-2]。肠腑特定穴下合穴上巨虚、募穴天枢及合募配伍是治疗胃肠病的常用穴位及配伍方式。研究表明，针刺治疗功能性便秘等胃肠病疗效显著[3-4]，但确切机制尚未明了。肠神经系统（enteric nervous system，ENS）的发现，以及近年对其功能、结构的深入研究，使之成为认识相关机制的重要切入点。研究表明，针灸对ENS 调节作用明确，有助于改善ENS 异常形态和功能，促进神经元恢复[5-6]。我们前期研究表明，不同腧穴对ENS 不同类型神经元具有特异性调节作用[7]。

ENS 正常生长发育及其功能完整性需多种神经营养因子调控，如神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子及脑源性神经营养因子（BDNF）等。然而，研究发现，肠道内BDNF 虽与肠动力密切相关，但并不能直接促进结肠运动，主要通过ENS 实现[8]。ENS是电针调节肠运动的重要环节，BDNF 又与ENS 密切相关，三者的复杂关系对揭示电针调节肠运动作用机制有重要意义。基于此，本研究制备功能性便秘小鼠模型，观察电针不同腧穴对肠运动、肠道内BDNF 及ENS 胆碱能神经元标志物乙酰胆碱转移酶（ChAT）表达的影响，以肠道内BDNF 为切入点，结合ENS，为电针调节肠运动机制研究提供新方向。

1 材料与方法

1.1 动物

C57BL/6J 小鼠106 只，雄性，3 周龄，体质量（20±4）g，河北医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（冀）2018-003，动物使用许可证号SYXK（冀）2018-008。饲养于温度21～23 ℃、相对湿度40%～60%环境，12 h 明暗交替，自由摄食饮水。适应性饲养1 周后进行实验。

1.2 主要试剂与仪器

红色碳粉（货号TNR618B，天津市登科化学试剂有限公司），乌拉坦（货号U0202-100G，上海青析化工科技有限公司），BDNF 抗体（货号ab108319，英国Abcam），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号AR0146，美国Thermo），电泳仪及转膜系统（货号 1658033，美国Bio-Rad），GAPDH 抗体（货号ab8245，英国Abcam），HRP 标记二抗（货号A21020，美国Abbkine），RIPA 蛋白裂解液（货号BL504A，北京兰杰柯科技有限公司），ChAT 抗体（货号ab178850，英国Abcam），SDS 蛋白上样缓冲液（货号P0015L，南京生兴生物技术有限公司）。Elx800 全自动检测酶标仪（美国 Bio-Tek），化学发光成像仪Bioshine ChemiQ 4800mini（上海欧翔科学仪器有限公司），HANS-100 韩式电针仪（南京济生医疗科技有限公司），华佗牌0.16 mm×7 mm 一次性针灸针（苏州医疗器械有限公司）。

1.3 造模及分组

参考文献[9-10]方法制备功能性便秘小鼠模型。所有小鼠单独置于防锈铁丝网笼子内（尿液可从网眼间隙渗透），给予生理盐水灌胃，首次0.2 mL/只，为防止动物机体出现耐受现象，每隔5 d 加0.05 mL/只，共14 d。为减少实验动物本身生物节律的干扰，在固定时间段即每日9:00 开始干预刺激。根据文献描述方法，观察小鼠9～14 d 粪便质量和性状改变，筛选出便秘小鼠。

随后将43 只便秘小鼠进行随机分组。在排便时间测定中分为模型组、上巨虚组和天枢组，每组5 只；上巨虚组和天枢组各5 只用于电生理实验。剩余18只用于Western blot 检测，分组同上，每组6 只。各实验中设相同数量正常小鼠为正常组。

1.4 电针干预

腧穴定位及操作参照《实验针灸学》[11]。上巨虚（ST 37）：小鼠胫骨外侧，偏下方6 mm 区域，直刺3～4 mm。“天枢”（ST 25）：小鼠前正中线旁开5 mm，耻骨联合以上20 mm 区域，直刺2～3 mm。电针参数为2/15 Hz，1 mA。在肠运动变化实验中，针刺时间为1 min；在肠功能测定实验中，电针干预时间为15 min/d，共3 d。

1.5 排便时间测定

实验前小鼠正常饮水，禁食12 h。给予红色碳粉悬浊液0.3 mL 灌胃，记录小鼠首粒粪便排出红色指示剂时间，为首粒红便时间。

1.6 肠运动变化分析

实验前小鼠正常饮水，禁食12 h，腹腔注射20%乌拉坦麻醉。打开腹腔，通过标志性器官进行定位，快速定位至盲肠，在其下方约1 cm 处开一个小口，将自制球囊测压探头放置于近端结肠内固定。手术完成后，禁止移动或改变压力探头位置。球囊测压探头一端放置于近端结肠内部，通过三通管连接至换能器和生物信号放大器，再至RM6240 生理信号采集系统[12-13]。向球囊内注入0.1～0.2 mL 水维持基线压力在0.1～0.8 kPa。

待肠内压波形出现，稳定20 min 后进行后续干预。每次电针干预前，记录1 min 波形作为基线值，再电针刺激相应腧穴，待波形恢复稳定，重复上述循环。RM6240 生理信号采集系统及相关分析软件记录数据，计算肠内压变化率。肠内压基线数据和电针干预时数据均取1 min 平均压。肠内压变化率（%）＝电针干预时基线÷基线×100%。若变化率绝对值＜5%视为无作用，＞5%视为加强/减弱结肠运动。

1.7 Western blot 检测

干预结束后，小鼠正常饮水禁食12 h，取等量近端结肠组织，提取蛋白。BCA 法测定蛋白浓度，取30 μg 样品经浓度为5%浓缩胶和12%分离胶进行电泳分离，转印至硝酸纤维素膜。5%BSA 封闭液中浸泡，参考蛋白Marker 对应标识，裁剪后分别加入BDNF（1∶1 000）、ChAT（1∶800）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育过夜。第2 日加入HRP 标记二抗，室温孵育2 h。加入发光液曝光以获得目的条带，使用凝胶成像分析仪进行拍照，以GAPDH 内参，计算目的蛋白相对灰度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS18.0 统计软件进行分析。计量资料以表示，电生理实验采用配对t检验，其他实验不同组间用方差分析并行两两比较。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针“上巨虚”“天枢”对便秘小鼠排便时间的影响

与正常组比较，模型组小鼠首粒红便时间明显延长（P＜0.01）；电针治疗后，与模型组比较，上巨虚组小鼠首粒红便时间明显缩短（P＜0.01），与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05），天枢组小鼠首粒红便时间明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），但未恢复至正常水平，与上巨虚组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠首粒红便时间比较（，每组5 只）

2.2 电针“上巨虚”“天枢”对便秘小鼠近端结肠运动的影响

与基线比较，上巨虚组小鼠结肠肠内压明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且肠内压变化率＞5%。见图2、图3。

图2 电针对2 组小鼠近端结肠肠内压变化的影响

图3 2 组小鼠近端结肠肠内压比较（，每组5 只）

2.3 电针“上巨虚”“天枢”对便秘小鼠近端结肠组织脑源性神经营养因子和乙酰胆碱转移酶表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠近端结肠组织BDNF和ChAT 蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；电针后，上巨虚组小鼠近端结肠组织BDNF 和ChAT 蛋白表达较模型组显著升高（P＜0.05，P＜0.01），且恢复至正常，天枢组小鼠近端结肠组织BDNF 和ChAT蛋白表达无明显变化，与正常组和上巨虚组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见图4～图7。

图4 各组小鼠近端结肠组织BDNF 蛋白免疫印迹图

图5 各组小鼠近端结肠组织BDNF 蛋白表达比较（，每组6 只）

图6 各组小鼠近端结肠组织ChAT 蛋白免疫印迹图

图7 各组小鼠近端结肠组织ChAT 蛋白表达比较（，每组6 只）

3 讨论

便秘属阳明腑证，多表现为胃肠不适，排便困难。上巨虚乃大肠之下合穴，《黄帝内经》有“治府者，治其合”“合治内府”，表明下合穴是治疗六腑病症主要腧穴之一。天枢作为大肠的募穴，《黄帝内经》记载“居阴阳升降之中，是为天枢”，可升降清浊，调脾胃、利大便。《难经》提到“阳病行阴，故令募在阴”，即治疗六腑病症多取募穴。研究表明，上巨虚和天枢常用于治疗便秘等胃肠疾病[14-15]。《脾胃论》记载“凡治腹之募，皆为元气不足”，但下合穴则常“通降腑气”，可见，在治疗过程中，二者作用不尽相同，各有侧重。

本研究结果表明，电针“上巨虚”“天枢”对便秘小鼠均有恢复作用，但效果并不完全相同。在近端结肠部位，“上巨虚”可促进肠运动，而“天枢”无明显作用。进一步研究发现，“上巨虚”可调节近端结肠内低表达的BDNF 至正常水平，而“天枢”无此作用。研究表明，肠道内BDNF 及其受体广泛分布[16-17]。有研究发现，在功能性消化不良患者胃肠内BDNF mRNA 水平显著下调[18]。此外有报道，小鼠BDNF 基因被敲除后肠动力显著下降[19]。可见，肠道内BDNF 正常水平参与维持肠动力的稳定。本研究结果也显示，便秘小鼠近端结肠内BDNF 表达明显下降，“上巨虚”和“天枢”对其调节作用亦不相同，提示肠道内BDNF 可能介导了二者的效应差异。

进一步研究发现，“上巨虚”可调节异常表达的ChAT 至正常水平，即恢复ENS 中受损的胆碱能神经元，而“天枢”无此作用，该结果与二者调节BDNF呈相似趋势。有研究曾提出，BDNF 并不能直接影响肠动力，而是通过联系ENS，加强突触间的传递，从而调节肠动力[20]。在ENS 中，胆碱能神经元即ChAT阳性神经元为主要的兴奋性神经元，通过释放乙酰胆碱（Ach）促进平滑肌收缩[21]。研究发现，突触活动可活化蛋白激酶C（PKC），随后参与调节Ach 释放，促进胆碱能收缩，而BDNF 与受体结合后可通过PKC信号转导加强突触活动，进一步影响胆碱能收缩[22]。另有研究发现，PKC 在发挥功能前需要被3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）激活，而PDK1 诱导PKC磷酸化必须由突触活动引起，BDNF 与受体结合后无法介导[23]。这可能是BDNF 并不能直接发挥作用的主要原因。由此可见，电针治疗便秘时，肠道内BDNF并非“类神经递质”的角色，电针可通过恢复ENS中ChAT 蛋白表达水平，从而调节Ach，促进胆碱能收缩，而BDNF 则进一步加强该作用。

肠道内BDNF 在电针过程中，以“放大器”样角色参与电针效应，即肠道内BDNF 通过联系ENS 胆碱能神经元介导了电针“上巨虚”和“天枢”的效应差异。BDNF 与受体结合后通过何种信号通路参与PKC信号转导从而介导电针效应，值得进一步深入研究。