侵染广西番茄的番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定

苏琴 崔丽贤 陈起民 谢慧婷 陈锦清 秦碧霞 朱英芝 李战彪 蔡健和

摘要 番茄黄化曲叶病毒病是番茄生产上的毁灭性病害，严重影响番茄产量及品质。2019年从广西百色市采集疑似番茄黄化曲叶病叶片样品，采用滚环扩增（RCA）及基因克隆等方法，获得了4个烟粉虱传双生病毒的全基因序列，4个分离物的全长序列分别为2 776、2 781、2 752、2 781 bp，均编码6个开放阅读框;核苷酸相似性比较发现，4个分离物彼此间的相似性均在90%以上，与已报道的番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）各分离物间的相似性也在91%以上;系统进化分析表明，TYLCV广西分离物BS-2和BS-4与TYLCV-Hunan，BS-1和BS-3与TYLCV-YN6553等分离物处于独立的小分支，说明TYLCV广西分离物与TYLCV-Hunan、TYLCV-YN6553具有较近的亲缘关系。本研究首次报道TYLCV在广西发生。

关键词 番茄; 番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）; 分子鉴定; 序列分析

中图分类号： S 436.412.11

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020278

Molecular identification of Tomato yellow leaf curl virus in Guangxi province

SU Qin1#， CUI Lixian1#， CHEN Qimin2， XIE Huiting1， CHEN jinqing1，

QIN Bixia1， ZHU Yingzhi2， LI Zhanbiao1， CAI Jianhe1*

（1. Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests， Research Institute of Plant

Protection， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2. College of Marine

and Biotechnology， Guangxi University of Nationalities， Nanning 530006， China）

Abstract

Tomato yellow leaf curl disease （TYLCD） is one of the devastating diseases in tomato production， seriously reducing the yield and quality of tomato. In 2019， suspected TYLCD leaf samples were collected from Baise city， Guangxi Zhuang autonomous region. Four complete gene sequences of begomovirues transmitted by Bemisia tabaci were obtained by using rolling circle amplification （RCA） and gene cloning. The full-length sequences of the four isolates were 2 776， 2 781， 2 752 bp， and 2 781 bp， respectively， encoding six open reading frames. The nucleotide sequence identities between the four isolates were over 90%， and their identities against other Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） isolates were over 91%. Phylogenetic analysis showed that TYLCV Guangxi isolates BS-2 and BS-4 clustered with TYLCV-Hunan， and BS-1 and BS-3 clustered with TYLCV-YN6553 in a sub-clade， indicating their close relation. This is the first report of TYLCV infecting tomato in Guangxi.

Key words

tomato; Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）; molecular identification; sequence analysis

番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）是一种严重危害番茄健康生产的毁灭性病毒，属双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus，基因组为单链环状DNA，由烟粉虱Bemisia tabaci以持久循环方式传播[1]。1964年，TYLCV首次在以色列被发现并正式命名，随后迅速向世界各地蔓延，给番茄等农作物生产造成了巨大的损失[1-3]。在我国，TYLCV于2006年首次在上海报道[4];随后在江苏、山东等20多个省市的番茄上被检测到，且造成严重的危害[5-23]。

广西是我国“南菜北运”的重要基地，番茄是其中重要的蔬菜品种，全区年种植面积约5.07万hm2，主要分布在百色、南宁和桂林等地。自2000年以来，随着传播媒介昆虫烟粉虱的暴发和扩散，番茄黄化曲叶病毒病连年猖獗，部分田块甚至绝收，给番茄生产造成了极大损失。前期研究发现，引起广西番茄黄化曲叶病毒病的病原主要包括：中国番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl China virus （TYLCCNV）、中国番木瓜曲叶病毒Papaya leaf curl China virus （PaLCuCNV）、中国胜红蓟黄脉病毒Ageratum yellow vein China virus （AYVCNV）、中國番茄曲叶病毒Tomato leaf curl China virus （ToLCCV）以及广西番茄曲叶病毒Tomato leaf curl Guangxi virus（ToLCGxV）等5种[24-25]，尚未有TYLCV的报道。2019年，本团队对广西番茄病毒病的病原进行监测，从采自百色市的番茄上检测到TYLCV，并对其基因序列进行了分析，明确该分离物的进化来源，为进一步指导番茄黄化曲叶病毒病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

从广西壮族自治区百色市田阳县（106.88°E，23.72°N）采集表现叶片黄化、卷曲、畸形、植株矮化等症状的番茄病叶12份，-20℃保存备用。

1.2 总DNA提取

取番茄叶片样品100 mg，用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）抽提叶片总DNA。具体操作按照试剂盒说明书进行。最后将DNA沉淀溶解于50 μL ddH2O中，-20℃保存备用。

1.3 PCR检测

利用菜豆金色花叶病毒属病毒通用简并引物AV494/CoPR[26-27]对番茄叶片总DNA进行PCR检测，以本实验室前期检测为阳性的番茄总DNA作为阳性对照，健康番茄叶片总DNA作为阴性对照。反应体系（20 μL）：总DNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物 AV494/CoPR 各0.5 μL，2×Taq MasterMix（Dye）（康为世纪生物科技有限公司） 10 μL， ddH2O 8 μL。

菌落PCR反应体系（10 μL）：10 μmol/L上下游引物 AV494/CoPR 各0.5 μL，2×Taq MasterMix（Dye）5 μL，ddH2O 4 μL，灭菌牙签挑取菌落作为模板溶解于PCR反应体系中。

PCR反应程序：95℃ 5 min;95℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 30 s，35个循环;72℃ 10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 全基因序列扩增

以PCR检测为阳性的番茄叶片总DNA为模板，利用TempliphiTM 100 Amplification Kit（GE Healthcare）进行滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）。具體方法参考试剂盒说明书进行，简述如下：灭菌PCR管中依次加入1 μL DNA和5 μL RCA溶液A，ddH2O补足至10 μL，95℃温育3 min;取出后冰浴5 min;随后加入5 μL RCA溶液 B和0.2 μL phi29 DNA聚合酶，ddH2O补足至20 μL，30℃温育4～16 h，反应结束后，扩增产物分别用BamH Ⅰ进行酶切。酶切反应体系（总体积10 μL）：RCA产物2 μL、内切酶1 μL、CutSmart 缓冲液1 μL、ddH2O 6 μL;37℃条件下酶切3 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并回收酶切产物。

1.5 基因克隆及序列分析

利用SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）回收RCA酶切产物，将经回收纯化的RCA产物克隆至经同样酶切且纯化的pGEM-3Z载体（广东农业科学院植物保护研究所汤亚飞博士惠赠）;转化大肠杆菌菌株DH5α，采用菌落PCR的方法筛选3个阳性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。所得序列经Vector NTI 11.0进行拼接后，使用NCBI的ORF Finder程序进行ORF 预测;利用MEGA 7.0的邻接法（neighbor joining， NJ）构建进化树，bootstrap设置为1 000。

2 结果与分析

2.1 番茄样品的PCR检测

利用菜豆金色花叶病毒属病毒简并引物AV494/CoPR对番茄叶片总DNA进行PCR检测，结果发现，采集的12份疑似番茄黄化曲叶病毒病的番茄样品中有8份扩增出与阳性对照大小一致的特异条带（570 bp），而健康番茄样品中未扩增出任何条带（图1）。结果表明，采集的番茄样品（8/12）受到菜豆金色花叶病毒属病毒的侵染。

2.2 病毒分离物基因组全序列克隆及分析

挑选部分PCR检测阳性的番茄总DNA（重新编号为：BS-1， BS-2，BS-3和BS-4），利用RCA试剂盒扩增病毒的全序列，将RCA产物进行酶切并进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示RCA产物均可以被BamH Ⅰ切出一条约2.7 kb大小的条带;将此条带回收纯化后克隆至同样经BamH Ⅰ 酶切的pGEM-3Z载体上并进行序列测定。所得序列经拼接比对后发现，采集自百色市田阳县的番茄样品BS-1， BS-2，BS-3和BS-4等4个分离物的全长序列分别为2 776、2 781、2 752、2 781 bp（Genbank登录号分别为：MT375608， MT375609， MT375610， MT375611），两两间序列的相似性均在90%以上。

进一步分析4个分离物的分子特征发现，4个分离物均为单链闭合环状DNA，编码6个开放阅读框（open reading frame， ORF）。其中病毒链编码AV1[外壳蛋白（coat protein， CP）， BS-1： 303-1 079 nt; BS-2和BS-4： 308-1 084 nt; BS-3： 302-1 078 nt]和AV2[移动蛋白（movement protein， MP）， BS-1： 143-493 nt; BS-2：148-498 nt; BS-3： 142-492 nt; BS-4： 148-477 nt]，互补链编码AC1[复制蛋白（replication protein， Rep）， BS-1： 1 537-2 610 nt; BS-2和BS-4： 1 542-2615 nt; BS-3： 1 536-2 615 nt]、AC2[转录激活蛋白 （transcription activator protein， TrAP）， BS-1： 1 221-1 628 nt; BS-2和BS-4： 1 226-1 633 nt; BS-3： 1 220-1 627 nt]、AC3[复制增强蛋白，（replication enhancer）， BS-1： 1 076-1 480 nt; BS-2和BS-4： 1 081-1 485 nt; BS-3： 1 075-1 479 nt]和AC4[症状决定因子（possibly determining symptom expression），BS-1： 2 166-2 459 nt; BS-2和BS-4： 2 171-2 464 nt; BS-3： 2 168-2 464 nt]。在基因AV2 与ACl 之间有278-313 nts （BS-1：142-2 611 nt; BS-2和BS-4：147-2 616 nt; BS-3：141-2 616 nt）的基因间隔区（intergenic region， IR），其中包含双生病毒复制起始相关的保守序列TAATATTAC。

将本研究中获得的基因序列与NCBI中已登录的序列进行比对分析发现，广西百色市的4个番茄分离物与GenBank中已登录的各TYLCV分离物具有较高的核苷酸相似性。进一步利用SDT软件进行比对分析发现，广西分离物（除BS3）的核苷酸序列与用于分析的TYLCV分离物的核苷酸序列的相似性均在91%以上。BS3与TYLCV-Iran和TYLACV-Abadeh的核苷酸相似性低于89%，与其余39个分离物的相似性均达到91%以上（图2）。

2.3 TYLCV广西分离物的进化分析

为了分析TYLCV广西分离物与已报道的TYLCV各分离物的亲缘关系，利用MEGA 7.0将广西分离物与41个TYLCV分离物构建了进化树（图3）。从图中可以看出，广西分离物BS-2和BS-4与部分国内分离物处于一个大的分支，与湖南的分离物TYLCV-Hunan （KY783940）则处于一个小的分支，说明BS-2和BS-4与湖南分离物TYLCV-Hunan亲缘关系最近;BS-1和BS-3则与云南分离物TYLCV-YN6553（MN503153）处于一个独立的小分支，说明BS-1和BS-3与YN6553亲缘关系最近。

3 讨论

TYLCV在世界各地有报道[1-3]，自2006年起我国20多个省市先后有该病毒侵染番茄的报道[4-23]。本研究利用PCR、RCA及基因克隆等方法检测、扩增出侵染广西番茄的4个双生病毒的全基因序列，通过分析各基因序列的分子特征及核苷酸相似性，证实4个病毒分离物的全基因序列分别为 2 776 bp（BS-1）、2 781 bp（BS-2）、2 752 bp（BS-3）、2 781 bp（BS-4），4个广西分离物与39个已报道的TYLCV的核苷酸相似性均大于91%，依据目前国际双生病毒分类标准[28]，确认这4个病毒分离物是TYLCV的分离物，加上之前检测到的5种双生病毒，侵染广西番茄的双生病毒至少有6种，从而加深了我们对广西番茄黄化曲叶病毒病复杂性和防控难度的认识。

自1995年首次报道双生病毒侵染番茄以来，本课题组对发生于广西的双生病毒进行了持续监测。本研究证实TYLCV侵染广西的番茄，而通过对4个TYLCV广西分离物的进化关系进行分析发现，TYLCV与云南、湖南两地的2个分离物的亲缘关系最近，可能具有相同的进化来源。烟粉虱的迁徙、种苗的调运及蔬菜作物的长距离贩运可能是该病毒迁入的主要途径。有研究表明，TYLCV可通过种子进行传播[29]，侵染广西的TYLCV是否是通过种子调运进入的仍待进一步研究证实。

广西地处亚热带地区，胜红蓟Ageratum conyzoides等多种杂草寄主以及番茄和各种瓜类等作物可周年生长，为介体昆虫烟粉虱滋生繁衍和番茄黄化曲叶病毒病的传播提供了便利条件。建议今后加强番茄抗病品种选育和评价研究，选育出兼抗TYLCV等多种双生病毒的广谱抗性品种。防治上要同时抓好无病壮苗培育，使用40目防虫网覆盖育苗苗床，远离或清除番木瓜Carica papaya等主要寄主植物;利用粘虫黄板或化学杀虫剂定期喷杀传毒介体-烟粉虱，减少传播介体;清除胜红蓟等中间寄主，减少初侵染源;适当调整播植期，避开病毒高发期。

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（责任编辑：杨明丽）