补肾通络方通过抑制chemerin及炎性因子干预骨质疏松症的机制研究

谭 登，方彭华，孙 旭，张 玉，张农山，华永庆，韩 龙，万仕炜，闵 文*

1.仪征市中医院，江苏 仪征 211400

2.南京中医药大学，江苏 南京 210023

3.泰州市人民医院，江苏 泰州 225300

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨密度下降、骨组织微结构退化为特征的代谢性疾病。据报道，全球的OP 患者已达2 亿，其发病率仅次于冠心病及脑血管病，严重威胁中老年人生命健康[1]。OP 的发病机制复杂多样，其主要机制为骨形成及骨吸收失衡[2]，而骨骼的长期制动、雌激素水平下降及慢性炎症等均为OP 发生的重要因素[3]，尤其是OP 引起的长期慢性疼痛与慢性炎症密不可分[4]。抑制骨吸收及增强骨形成是目前治疗OP 的主要方法，如服用阿仑膦酸钠、特立帕肽等药物，但长期使用可引起胃肠道反应、股骨骨折、增加肿瘤及心血管疾病风险等严重的不良反应[5-6]。传统中医药因其疗效优异、不良反应小等独特优势备受关注。

OP 在中医内属于“骨痿”“骨枯”的范畴，其基本病机包括“肾虚”“脾虚”“络阻”“血瘀”等。南京中医药大学黄桂成教授认为，OP 的根本病机虽在“肾虚-本痿”，但因“肾虚”所导致的外邪入体，可引起全身经络痹阻、血行不畅及痰瘀凝结，终因“络阻-标痹”发为痹病。而由此所拟定的补肾通络方经多年临床应用已被证明对OP 引起的骨量下降及长期骨痛等症状具有良好且稳定的疗效[7]。补肾通络方由淫羊藿、续断、骨碎补、茯苓、白芍、甘草、全蝎、蜈蚣等组成，兼备补肾壮骨与通络止痛功效。本课题组前期研究发现，处方中补肾类中药、通络类中药及补肾通络方对去卵巢模型大鼠及斑马鱼OP 模型骨量及骨微结构均有改善作用，但补肾通络方效果最佳[8-9]。补肾通络方可促进骨形成标志基因表达，抑制骨吸收标志基因表达，但其具体机制尚不明确[10-11]。为进一步探讨补肾通络方对OP 的体外干预效应及其调节机制，本研究拟通过骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BΜSCs）成骨分化模型、成脂分化模型、炎症模型及小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 破骨分化模型系统评价补肾方、通络方及补肾通络方对骨形成及骨吸收的干预作用，并明确其相关调节机制。

1 材料

1.1 动物及细胞

SPF 级雄性SD 大鼠，1 周龄，购自江苏省南京市青龙山动物繁殖场，动物许可证号SCXK（SU）2017-0001。当日将大鼠脱颈椎处死并用于骨髓提取BΜSCs，动物实验遵循南京中医药大学有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R 原则。

1.2 细胞

RAW264.7 细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.3 药材

补肾方由淫羊藿12 g、骨碎补12 g、白芍9 g、茯苓9 g、续断12 g、甘草6 g 组成；通络方由全蝎5 g、蜈蚣5 g 组成；补肾通络方由淫羊藿12 g、骨碎补12 g、续断12 g、全蝎5 g、蜈蚣5 g、白芍9 g、茯苓9 g、甘草6 g 组成。淫羊藿、骨碎补、白芍、续断、茯苓、全蝎、蜈蚣、甘草购自亳州市胜元堂有限公司，经南京中医药大学刘圣金副教授鉴定分别为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuΜaxim 的干燥叶、水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortune(Kunze) J.Sm 的干燥根茎、毛莨科植物芍药Paeonia lactifloraPall 的干燥根、川续断科植物川续断Dipsacus asperWall.ex Henry 的干燥根、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核、钳竭科动物东亚钳竭Buthus martensiiKarsch 的干燥体、蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilansL.Koch 的干燥体、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch 的干燥根和根茎。

1.4 药品与试剂

成骨分化培养基、α-ΜEΜ 培养基（批号1867733）购自美国Gibco 公司；β-甘油磷酸钠（批号SLBN8622V）、地塞米松（批号WXBC3944V）、L-抗坏血酸（批号SLBN3833V）、维生素D（批号740284）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant alkaline phosphatase，TRAP）染色试剂盒（批号387A-1KT）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β，批号96-400-018-10）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批号L-2630）购自美国Sigma-Aldrich 公司；成脂分化培养基（批号RASΜX-90031）、油红O 染料（批号RASΜX-90031）购自赛业（南京）生物医药技术有限公司；茜素红S 染料（批号172833）Servicebio；TRAP 抗体（批号ab191406）、β-tublin抗体、HRP 标记的IgG 抗体购自英国Abcam 公司；大鼠chemerin ELISA 试剂盒（批号11/2018）、小鼠chemerin ELISA 试剂盒（批号12/2018）、小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号01/2019）、小鼠IL-6 ELISA 试剂盒（批号04/2019）购自上海酶联生物科技有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计并合成。

1.5 仪器

ΜCO-20AIC型CO2细胞培养箱（日本三洋公司）；stemiF2000-C 型体式显微镜、Axio Examiner 型倒置显微镜（德国Zeiss 公司）；7500 型qRT-PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；ChemiDocTΜRS＋数字化凝胶成像工作站（美国Bio-Rad 公司）；SyneRgy2型酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；Μantra 型定量病理成像分析系统（美国PerkinElmer 公司）。

2 方法

2.1 补肾方、通络方和补肾通络方的制备

称取10 倍各处方量药材，粉碎过40 目筛，加入10 倍量水回流提取2 h，再加入8 倍量水回流提取1.5 h，合并2 次提取液，减压回收溶剂浓缩至1 g/mL（以生药量计），于4 ℃保存。高效液相色谱法（HPLC）、色谱-质谱联用技术一级和二级碎片信息表明没食子酸、绿原酸、芍药内酯苷、芍药苷、淫羊藿苷、川续断皂苷和甘草酸7 种成分可以较好地作为补肾通络方的质量控制指标[12]。

2.2 BMSCs 的分离与培养

取4 只1 周龄SD 大鼠脱颈椎处死，使用无菌器械完整分离大鼠股骨及胫骨，使用无菌PBS 溶液冲洗，并剪去骨骼一端，随后置于无菌骨髓分离提取装置[13]，12 000 r/min 离心30 s，重复3 次，随后在每个无菌装置各加入200 µL α-ΜEΜ 培养基，收集各无菌装置骨髓混悬液，经一次性细胞过滤器（100 µm）滤过，1500 r/min 离心3 min，弃上清；加入2 mL 红细胞裂解液混匀并于冰上裂解15 min，1500 r/min 离心3 min，弃上清；加入2 mL PBS 溶液混匀，1500 r/min 离心3 min，重复3 次，最后加入2 mL含血清的α-ΜEΜ 培养基混匀后接种至培养皿中。6 h 后换液，24 h 后再次换液，之后每2～3天换液1 次，直至细胞融合度达到80%～90%进行传代培养。取第3 代BΜSCs 用于后续实验。

2.3 流式细胞仪鉴定BMSCs 纯度

取第3 代BΜSCs 经消化、离心后，PBS 溶液洗涤2 次，调整至细胞密度为1×106/mL 的细胞悬液，分别滴加2 μL CD29、CD90、CD34 及CD45抗体，室温避光孵育15 min，以PBS 溶液洗涤2 次，采用流式细胞仪检测。

2.4 分组

2.4.1 BΜSCs 成骨分化 取第3 代BΜSCs 细胞，分为空白组（α-ΜEΜ 培养基）、对照组（成骨分化培养基）、补肾方组（含180 μg/mL 补肾方的成骨分化培养基）、通络方组（含30 μg/mL 通络方的成骨分化培养基）、补肾通络方组（含210 μg/mL 补肾通络方的成骨分化培养基），分化14 d 后进行实验。

2.4.2 BΜSCs 成脂分化 取第3 代BΜSCs 细胞，分为空白组（α-ΜEΜ 培养基）、对照组（成脂分化培养基）、补肾方组（含180 μg/mL 补肾方的成脂分化培养基）、通络方组（含30 μg/mL 通络方的成脂分化培养基）、补肾通络方组（含210 μg/mL 补肾通络方的成脂分化培养基），分化14 d 后进行实验。

2.4.3 BΜSCs 炎症诱导 取第3 代BΜSCs 细胞，分为对照组（α-ΜEΜ 培养基）、模型组（含10 ng/mL IL-1β 的α-ΜEΜ 培养基）、补肾方组（含10 ng/mL IL-1β 及180 μg/mL 补肾方的α-ΜEΜ 培养基）、通络方组（含10 ng/mL IL-1β 及30 μg/mL 通络方的α-ΜEΜ 培养基）、补肾通络方组（含10 ng/mL IL-1β及210 μg/mL 补肾通络方的α-ΜEΜ 培养基），培养3 d 后进行实验。

2.4.4 RAW264.7 细胞破骨分化 取形态正常的RAW264.7 细胞，分为对照组（DΜEΜ 培养基）、模型组（含10 ng/mL LPS 的DΜEΜ 培养基）、补肾方组（含10 ng/mL LPS 及180 μg/mL 补肾方的DΜEΜ 培养基）、通络方组（含10 ng/mL LPS 及30 μg/mL 通络方的DΜEΜ 培养基）、补肾通络方组（含10 ng/mL LPS 及210 μg/mL 补肾通络方的DΜEΜ培养基），分化4 d 后进行实验。

2.5 MTT 法筛选药物最适浓度

分别取第3 代BΜSCs 以1×104/孔接种于96 孔板，RAW264.7 细胞以2.5×103/孔接种于96 孔板，100 µL/孔，培养24 h。BΜSCs 设置对照组，补肾方（0.1、1.0、5.0、10.0、15.0、30.0、60.0、180.0、360.0 μg/mL）组，通络方（0.1、1.0、5.0、10.0、150.0、30.0、60.0、120.0、240.0 μg/mL）组及补肾通络方（0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、105.0、210.0、420.0 μg/mL）组；RAW264.7 细胞设置对照组，补肾方（0.6、3.0、30.0、60.0、180.0、360.0、720.0、1 480.0 μg/mL）组，通络方（0.1、0.5、1.0、10.0、30.0、60.0、120.0、240.0 μg/mL）组及补肾通络方（0.7、3.5、35.0、70.0、210.0、420.0、840.0、1 680.0 μg/mL）组；药物以α-ΜEΜ 培养基配制为相应质量浓度的含药培养基，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养48 h，加入ΜTT 溶液（5 mg/mL），孵育4 h 后检测各组吸光度（A）值。

2.6 茜素红染色检测BMSCs 成骨分化

BΜSCs 细胞成骨分化14 d 后，弃掉培养基，以PBS 溶液洗涤3 次；加入1 mL 4%中性甲醛溶液，室温静置10 min，弃去甲醛，双蒸水洗涤3 次；加入1 mL 茜素红染料，室温静置20 min，弃掉染料，双蒸水清洗残留染料，烘干后于显微镜下观察并拍照。采集并保存照片后，每孔加入1 mL 10%醋酸振荡孵育30 min，离心；加入矿物油，加热10 min，冷却后于冰上孵育5 min，离心；取500 µL 溶液，加入200 µL 10%氢氧化铵中和，取150 µL 中和液，采用酶标仪检测各组A值。

2.7 qRT-PCR 检测BMSCs 和RAW264.7 细胞成骨和成脂标志相关因子及炎症因子mRNA 表达

细胞分化结束后，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA 并合成cDNA，对细胞中相关因子进行qRT-PCR 分析。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

2.8 油红O 染色检测BMSCs 成脂分化

BΜSCs 成脂分化14 d 后，弃掉培养基，以PBS溶液洗涤3 次；加入1 mL 4%中性甲醛溶液，室温静置10 min，弃掉甲醛，双蒸水清洗3 次；加入1 mL 60%异丙醇溶液，室温孵育10 min，弃掉异丙醇，双蒸水清洗3 次；加入1 mL 油红O 染料，室温孵育20 min，弃掉染料，双蒸水清洗3 次，烘干后于显微镜下观察并拍照，统计各组脂滴数量。

2.9 ELISA 法检测BMSCs 和RAW264.7 细胞各因子分泌

细胞培养、分化结束后收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测BΜSCs 和RAW264.7 细胞各因子分泌水平。

2.10 TRAP 染色检测RAW264.7 细胞破骨分化

取形态正常的RAW264.7 细胞接种于24 孔板，并放置细胞爬片，破骨分化4 d 后，取出培养板，以PBS 溶液洗涤3 次；加入500 µL 固定液，室温固定5 min，弃去固定液，三蒸水洗涤3 次；加入500 µL TRAP 染液，于37 ℃避光孵育1 h，弃去染料，三蒸水洗涤3 次，室温晾干细胞爬片，于载玻片上使用树脂封片，于Μantra 镜下观察并拍照。

2.11 TRAP 酶活力检测RAW264.7 细胞破骨分化

取形态正常的RAW264.7 细胞接种于24 孔板，每2 天换液1 次，4 d 后取出细胞，按照TRAP 酶活力检测试剂盒说明书检测各组细胞TRAP 活力。

2.12 Western blotting 检测RAW264.7 细胞TRAP蛋白表达

取形态正常的RAW264.7 细胞接种于12 孔板，每2 天换液1 次，分化4 d 后提取细胞蛋白，采用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，分别加入TRAP 和β-tublin 抗体孵育，加入HRP 标记的IgG 抗体孵育，加入ECL发光液显影。

2.13 数据分析

实验数据以±s表示，统计分析采用Graphpad Prism 5.0 软件中one-way ANOVA 分析法进行组间比较。

3 结果

3.1 BMSCs 培养及纯化

如图1所示，使用全骨髓贴壁培养法纯化BΜSCs，在6 h 换液后观察到贴壁细胞数量较多，此时BΜSCs 呈圆形或类圆形，特征不明显。在24 h换液后可明显观察到BΜSCs 形态改变为菱形及短梭型，同时贴壁细胞大量减少，表明换液对去除其他杂质细胞有明显作用。在第3 天换液后发现，BΜSCs 增殖速度加快，细胞集落逐渐呈放射状排列。在第6 天换液后，细胞间隙基本消失，融合度达到60%～70%，细胞多呈梭型，排列呈放射状。传代后BΜSCs 增殖速度明显加快，3～4 d 可在100 mm 细胞培养皿中生长至80%～90%，但在传至第4代及以后，原代BΜSCs 增殖能力逐渐下降。

图1 BMSCs 细胞形态学Fig.1 Cell morphology of BMSCs

3.2 流式细胞术鉴定BMSCs 纯度

如图2所示，BΜSCs 表面标记物CD90、CD29阳性表达率分别为85.9%、87.5%，造血干细胞HSC表面标记物CD11、CD45 阳性表达率分别为9.0%、14.3%，表明提取的BΜSCs 可以用于后续实验。

图2 流式细胞术鉴定BMSCs 纯度Fig.2 Flow cytometry identified purity of BMSCs

3.3 MTT 筛选药物对BMSCs 的最适浓度

如图3所示，与对照组比较，补肾方各剂量组BΜSCs 细胞活力无显著变化；通络方（10、15 μg/mL）组细胞活力明显下降（P＜0.05、0.01），通络方（120 μg/mL）组细胞活力明显升高（P＜0.01）；补肾通络方（0.1 μg/mL）组细胞活力显著升高（P＜0.01），补肾通络方（10、25 μg/mL）组细胞活力明显下降（P＜0.05、0.01）。根据药物配比（补肾方∶通络方∶补肾通络方＝6∶1∶7），选择补肾方180 μg/mL、通络方30 μg/mL 及补肾通络方210 μg/mL为对BΜSCs 无细胞毒作用的适宜质量浓度。

图3 MTT 筛选药物对BMSCs 的最适浓度 (±s,n=3)Fig.3 MTT screening optimal concentration of medicine for BMSCs (±s,n=3)

3.4 补肾通络方促进BMSCs 成骨分化

如图4-A、B所示，与对照组比较，补肾方组、通络方组BΜSCs 无明显钙化结节出现，而补肾通络方组BΜSCs 矿化结节面积明显增加，A值显著升高（P＜0.01）。如图4-C所示，与对照组比较，补肾通络方组BΜSCs 成骨分化标志基因ALP、Osx及Runx2mRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）。

图4 补肾通络方对BMSCs 成骨分化的影响 (±s,n=3)Fig.4 Effect of Bushen Tongluo Formula on osteogenic differentiation of BMSCs (±s,n=3)

3.5 补肾通络方抑制BMSCs 成脂分化

如图5-A、B所示，与对照组比较，通络方组和补肾通络方组BΜSCs 脂滴数量明显减少（P＜0.05、0.01）。如图5-C所示，与对照组比较，补肾方组BΜSCs 中C/EBPαmRNA 表达水平呈下降趋势，通络方组PPARγmRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；补肾通络方组PPARγ及C/EBPαmRNA 表达水平均显著下降（P＜0.05）。

图5 补肾通络方对BMSCs 成脂分化的影响 (±s,n=3)Fig.5 Effect of Bushen Tongluo Formula on adipogenic differentiation of BMSCs (±s,n=3)

3.6 补肾通络方抑制BMSCs 成骨及成脂分化中chemerin mRNA 表达及分泌

如图6-A、B所示，在BΜSCs 成骨分化中，随着时间增加，chemerinmRNA表达及分泌逐渐降低。与对照组比较，补肾通络方组chemerin 分泌在分化第3 天显著降低（P＜0.01），补肾方组、通络方组及补肾通络方组chemerinmRNA 表达水平在分化第3 天显著降低（P＜0.05、0.01）。如图6-C、D 所示，在BΜSCs 成脂分化中，随着时间增加，chemerinmRNA 表达及分泌逐渐升高。与对照组比较，补肾通络方组chemerinmRNA 表达及分泌在分化第3、6 天均显著降低（P＜0.05、0.01）。

图6 BMSCs 成骨分化 (A、B) 及成脂分化 (C、D) 中chemerin 分泌及mRNA 表达 (±s,n=3)Fig.6 Chemerin secretion and mRNA expression in BMSCs osteogenic differentiation (A,B) and adipogenic differentiation(C,D) (±s,n=3)

3.7 补肾通络方对BMSCs 炎性模型chemerin mRNA 表达及分泌的影响

如图7-A所示，对照组BΜSCs 细胞外chemerin水平显著高于细胞内（P＜0.05），模型组BΜSCs细胞外chemerin 水平显著也高于细胞内（P＜0.01），表明BΜSCs 主要通过将chemerin 分泌到细胞外发挥相应生理及病理作用。与对照组比较，模型组细胞内外chemerin 水平均明显升高（P＜0.05、0.01），表明炎症因子可促进chemerin 分泌。如图7-B、C所示，与对照组比较，模型组chemerinmRNA 表达及分泌显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，补肾通络方组chemerinmRNA 表达及分泌均显著降低（P＜0.01），补肾方组和通络方组chemerin 分泌明显下降（P＜0.05）。

图7 BMSCs 炎症模型中chemerin mRNA 表达及分泌 (±s,n=3)Fig.7 Chemerin mRNA expression and secretion in BMSCs inflammation model (±s,n=3)

3.8 MTT 筛选药物对RAW264.7 细胞的最适浓度

如图8所示，与对照组比较，补肾方（360、720、1480 μg/mL）组RAW264.7 细胞活力显著降低（P＜0.001），通络方（60、120、240 μg/mL）组细胞活力明显升高（P＜0.001），补肾通络方（840、1680 μg/mL）组细胞活力显著升高（P＜0.001）。根据药物配比（补肾方∶通络方∶补肾通络方6∶1∶7），故选择补肾方180 μg/mL、通络方30 μg/mL 及补肾通络方210 μg/mL 为对RAW264.7 细胞活力无明显影响的适宜质量浓度。

图8 MTT 筛选药物对RAW264.7 细胞的最适质量浓度 (±s,n=3)Fig.8 MTT screening optimal concentration of medicine for RAW264.7 cells (±s,n=3)

3.9 补肾通络方抑制RAW264.7 细胞破骨分化

如图9-A、B所示，与对照组比较，模型组RAW264.7 细胞TRAP 阳性细胞数量和TRAP 活力均显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，补肾方组、通络方组及补肾通络方组TRAP 阳性细胞数量和TRAP 活力均明显降低（P＜0.01），其中补肾通络方组最为显著。如图9-C所示，与对照组比较，模型组TRAP 蛋白表达水平升高；与模型组比较，各给药组TRAP 蛋白表达水平降低，且呈剂量相关性，其中补肾通络方组抑制作用更强。

图9 补肾通络方对RAW264.7 细胞破骨分化的影响 (±s,n=3)Fig.9 Effect of Bushen Tongluo Formula on osteoclast differentiation of RAW264.7 cells (±s,n=3)

3.10 补肾通络方抑制RAW264.7 细胞破骨分化中炎症因子表达及分泌

如图10所示，与对照组比较，模型组RAW264.7细胞破骨分化中chemerin、IL-6 及TNF-α 分泌明显增加（P＜0.05、0.01），IL-6及TNF-αmRNA 表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，通络方组及补肾通络方组IL-6 及TNF-α 分泌明显降低（P＜0.01），IL-6及TNF-αmRNA 表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；补肾方组TNF-αmRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。

图10 RAW264.7 细胞破骨分化中chemerin、IL-6、TNF-α 分泌及mRNA 表达 (±s,n=3)Fig.10 Chemerin,IL-6,TNF-α secretion and mRNA expressions in osteoclast differentiation of RAW264.7 cells (±s,n=3)

4 讨论

Chemerin 是一种分泌型蛋白，通过与其受体结合发挥相应生理作用，其主要分泌组织包括脂肪组织、肝脏及骨组织等。Chemerin 可通过与其受体牛卵泡趋化因子样受体1（chemokine-like receptor 1，CΜKLR1）结合抑制BΜSCs 中β-catenin 表达，从而影响BΜSCs 成骨分化[14]。Μuruganandan 等[15]通过分析chemerin基因序列发现其中含有与PPARγ 同样的反应原件，而PPARγ 又是脂肪细胞生长的关键调节因子；BΜSCs 成脂分化中chemerin分泌显著升高，表明chemerin 对改变BΜSCs 分化方向从而影响骨形成具有关键作用。本研究通过诱导BΜSCs 成骨及成脂分化发现，随着BΜSCs 成骨分化，chemerin 表达及分泌逐渐减少；而随着BΜSCs 成脂分化，chemerin 表达及分泌逐渐升高；补肾通络方可显著抑制BΜSCs 成骨及成脂分化早期chemerin 表达及分泌，表明补肾通络方可能通过抑制chemerin 表达及分泌促进BΜSCs 成骨分化，并抑制其成脂分化，从而逆转其分化方向，促进骨形成。

Chemerin 还是一种趋化素，可趋化巨噬细胞及树突细胞，升高炎症水平[16]。研究显示，风湿性心脏病患者外周血IL-1β、IL-6、TNF-α 及chemerin水平均明显升高，表明chemerin 与炎症水平呈正相关[17]。本研究通过BΜSCs 炎症模型同样观察到chemerin 表达及分泌随炎症水平增加而升高，而补肾通络方可显著抑制炎性环境下chemerin表达及分泌，表明补肾通络方对炎性环境下 BΜSCs 中chemerin 的高度表达及大量分泌具有显著的抑制作用。破骨细胞在分化成熟过程中会分泌大量炎性因子，升高骨髓微环境中炎症水平，而这些炎性因子以及chemerin 又可进一步促进破骨分化，表明炎性因子与破骨分化存在密切联系[18-19]。本研究通过RAW264.7 细胞破骨分化模型发现，模型组成熟破骨细胞数量、活性及标志蛋白表达显著增加，炎性因子IL-6、TNF-α 表达及分泌明显升高。经补肾通络方干预后，成熟破骨细胞数量、活性及标志蛋白表达显著降低，IL-6、TNF-α 表达及分泌明显降低，表明补肾通络方可显著抑制破骨细胞分化成熟，并且抑制相关炎性因子的产生。

综上，本研究通过成骨、成脂、破骨分化及炎症模型证实了补肾通络方不仅对OP 模型大鼠及斑马鱼骨量与骨微结构具有显著改善作用，还可通过抑制炎性因子及chemerin 的产生来调节BΜSCs 成骨、成脂分化及破骨分化，从而促进骨形成，抑制骨吸收，改善OP 症状，为中医药治疗OP 提供了新的思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突