低分子肝素对子宫内膜容受性的作用及其机制研究

牛凯迪，王春雪，于月新

（中国医科大学北部战区总医院 生殖医学中心，辽宁 沈阳110016）

良好的子宫内膜容受性有利于胚胎植入，而Wnt 通路在子宫内膜容受性中起关键作用[1]。Wnt/β-catenin 为经典的Wnt 信号通路，异常的β 连环蛋白表达将损害胚胎黏附和子宫内膜蜕膜化[2]。蜕膜化主要由孕激素引起，是子宫内膜基质细胞向蜕膜细胞转化和子宫内膜血管床改变的过程。当这些变化不足时，胚泡无法嵌入，导致早期妊娠失败[3]。妊娠期间，蜕膜细胞产生对胚胎发育至关重要的激素和细胞因子，分泌控制滋养层浸润的因子[2]。有学者发现低分子肝素（LMWH）促进绒毛外滋养层细胞的分化和侵袭[4]。LMWH 调控白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的胚胎干细胞中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-11（IL-11）、白血病抑制因子的产生[5]，调节趋化因子[6]并增加胰岛素样生长因子和泌乳素[7]，其对细胞因子的调节超出抗凝作用。临床LMWH 常经验性用药，但其对子宫内膜容受性影响的相关机制尚不清楚。本研究拟通过米非司酮复制胚泡植入障碍模型，进一步探究LMWH 对小鼠子宫内膜容受性的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

试剂：TrizolTMReagent（美国Invitrogen 公司），逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒（上海近岸蛋白科技有限公司）。 仪器： 荧光定量PCR 仪（ABI7500，美国Applied Biosystems 公司），荧光倒置显微镜（DM4000B，德国Leica 公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物和分组48 只C57BL/6 雌鼠和16只C57BL/6 雄鼠[实验动物生产许可证：SCXK（辽）2015-0001，实验动物使用许可证：SYXK （军）2012-0003]喂养于平均湿度（55±10）%、平均温度（22±2）℃和明暗（12 h/12 h）控制的房间内，可自由进食和饮水。适应性饲喂1 周后，随机将雌鼠分为对照组、造模组、LMWH 低剂量造模组和LMWH 高剂量造模组。本实验获得中国医科大学北部战区总医院伦理委员会的批准（No：2019004）。

1.2.2 模型复制将25 mg 米非司酮片剂溶于31 ml丙二醇中配成0.8g/L 米非司酮溶液。于妊娠第4 天上午9∶00 皮下注射米非司酮溶液0.1 ml。

1.2.3 处理方法每日行脱落细胞学检查，若为发情前期或发情期，于当晚5 点合笼，第2 天观察到阴道栓或涂片发现精子，记为妊娠第1 天。自该日起，对照组、造模组每日皮下注射生理盐水，LMWH 低剂量造模组、LMWH 高剂量造模组分别皮下注射100 IU/kg、150 IU/kg 的LMWH，持续至妊娠第4 天。妊娠第5 天上午行脊椎脱臼法处死小鼠。取出子宫内膜，统计胚胎数量。将子宫分成两段，一段液氮速冻后，立即放入-80℃冰箱，另一段放入4%的多聚甲醛内避光待检。

1.3 检测指标

1.3.1 子宫内膜组织学检测经垂直包埋，石蜡切片，苏木素-伊红染色法染色、脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察子宫内膜厚度和子宫内膜形态变化，并进行组间比较。

1.3.2 qRT-PCR将子宫组织剪碎，按照试剂盒说明提取RNA。逆转录后进行qRT-PCR，扩增条件：95℃预变性1 min，95℃变性20 s，60℃退火1 min，共40 个循环。每孔加样3 份，重复3 次。检测每组血小板内皮细胞黏附因子1（PECAM1）、同源框基因A10 （HOXA10）、Wnt7A 和β-catenin 的mRNA 水平。相对表达量以2-△△Ct表示。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用方差分析，进一步的两两比较用LSD-t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LMWH对小鼠胚胎着床数量的影响

造模组子宫比对照组瘦、短，LMWH 低剂量造模组和LMWH 高剂量造模组子宫明显较肥厚（见图1）。各组胚胎数量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05），LMWH 低剂量造模组和LMWH 高剂量造模组较造模组增加（P<0.05），LMWH 高剂量造模组最高；LMWH 高剂量造模组较对照组增加（P<0.05）。见表2 和图2。

图1 子宫图

图2 各组胚胎数量比较 （±s）

2.2 子宫内膜HE染色

造模组子宫内膜厚度薄，间质致密；LMWH低剂量造模组和LMWH 高剂量造模组子宫内膜增厚，子宫腺弯曲，腺腔扩大，螺旋动脉更长、更弯曲，间质呈生理性水肿，局部内膜疏松，LMWH高剂量造模组尤为明显。各组腺体数量、血管数量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05），LMWH 低剂量造模组和LMWH 高剂量造模组较造模组增加（P<0.05），而LMWH 造模组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2和图3。

表2 每组胚胎、腺体及血管数量比较 （n=12，±s）

表2 每组胚胎、腺体及血管数量比较 （n=12，±s）

注：①与造模组比较，P<0.05；②与对照组比较，P<0.05。

组别对照组造模组LMWH低剂量造模组LMWH高剂量造模组F 值P 值胚胎数量8.08±0.79 6.00±0.74 8.50±0.67①9.17±0.58①②45.685 0.000腺体数量18.93±3.75 13.33±4.38 17.39±3.86①20.83±2.82①8.692 0.000血管数量16.27±2.24 11.87±3.58 16.58±3.81①16.84±2.52①6.897 0.001

图3 HE染色图 （×200）

2.3 各组HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相对表达量比较

各 组HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05），LMWH 低剂量造模组和LMWH高剂量造模组较造模组增加（P<0.05）。结果表明，LMWH 可以改善子宫内膜情况，提高胚胎植入，作用机制与Wnt 通路和PECAM1、HOXA10 相关；LMWH 高剂量疗效更佳，能更好地提高子宫内膜容受性。见表3 和图4。

表3 各组HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相对表达量比较 （n=12，±s）

表3 各组HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相对表达量比较 （n=12，±s）

组别对照组造模组LMWH低剂量造模组LMWH高剂量造模组F 值P 值HOXA10 1.01±0.42 0.28±0.13 1.62±0.89 2.08±0.68 10.150 0.000 PECAM1 1.00±0.29 0.33±0.16 1.62±0.84 2.01±0.72 9.652 0.000 Wnt7A 1.00±0.47 0.28±0.18 2.37±0.90 4.11±0.91 36.350 0.000 β-catenin 1.00±0.58 0.15±0.07 1.24±0.29 2.26±0.52 3.734 0.028

图4 各组HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相对表达量比较 （±s）

3 讨论

HOXA10 作为子宫内膜容受性标志物，在分泌中期达到峰值[8]，这一时间与植入窗口期相同，其含量增加提示子宫内膜容受性的提高。本研究发现经过LMWH 治疗后的小鼠，HOXA10 含量与造模组相比显著增加。提示LMWH 存在提高子宫内膜容受性的作用，且这一作用与用药剂量相关。

Wnts 是小鼠子宫形态发生和胚泡植入的重要调节因子[9]，其失调会导致腺体形成、蜕膜化和生育能力的缺陷。本研究发现，经LMWH 低剂量治疗后，胚胎植入数量高于造模组，HE 染色新生血管的数量也较多。从分子层面来说，与造模组相比，不同剂量LMWH 造模组Wnt7A mRNA 和βcatenin mRNA 含量都显著增加，LMWH 高剂量造模组效果优于LMWH 低剂量造模组。以上结果表明，LMWH 可以明显改善胚泡植入失败子宫内膜容受性，进而有利于胚胎植入。并且LMWH 作用通路可能为Wnt 通路。

胚胎和母体子宫内膜之间复杂的相互作用是着床过程的第一步，类固醇激素在其中发挥作用。孕激素与Wnt 通路相关，可影响人子宫内膜上皮细胞中的Wnt7A[10-11]。孕酮可在去卵巢小鼠体内诱导子宫内膜血管生成[12]，血管生成和重塑过程为母胎界面提供充足的血液供应，这对成功着床至关重要[13]。

PECAM1 作为新生血管的标志物，负责囊胚植入过程中胎盘的血流[14]。本研究发现，不同剂量LMWH 造模组PECAM1 较造模组显著增加，说明LMWH 可能通过增加血管生成促进胚胎植入。胎盘血管生成对于正常胎盘循环以及胎儿发育至关重要，滋养层浸润不足将导致血管-胎盘功能不全[15]。体外细胞培养发现，LMWH 可以促进滋养细胞侵袭，与本研究结果一致[16]。本研究仍有一定不足，只证明了LMWH、PECAM1 与Wnt 有关，未明确LMWH 作用靶点是PECAM1。母胎界面分子机制极为复杂，Wnt 可能不是LMWH 唯一作用通路，这些都值得进一步研究。