近距离放疗调节抗肿瘤免疫效应的研究进展*

李虎子 综述 赵路军 审校

近距离放射治疗（brachytherapy，BT），又称内照射，是一种使用能量较低的放射性核素临时或永久的直接植入到肿瘤内部的放疗方法。BT 照射剂量在靶区内高度适形分布，被视作适形放疗的一种形式，与外照射均是重要的放疗手段。其中，临时植入的高剂量率近距离放射治疗（high-dose-rate BT，HDR-BT）和永久植入的低剂量率近距离放射治疗（low-dose-rate BT，LDR-BT）临床应用比较普遍[1]。近年来，又有学者将其归纳为立体定向近距离消融（stereotactic ablation brachytherapy，SABT）。因此，BT 同时也是一种达到肿瘤“原位疫苗”理想的治疗措施[2]，并激活抗肿瘤免疫效应，促使远处未经治疗的转移瘤亦可出现明显的自发消退，即放疗的“远隔效应”[3-4]。不同的放疗方案对抗肿瘤免疫反应的影响不尽相同，本文就BT 调节抗肿瘤免疫效应的研究进展进行综述。

1 BT 诱导肿瘤细胞的死亡和免疫性抗原的释放

BT 通过诱导DNA 损伤和阻断细胞分裂，抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡或坏死，直接发挥抗肿瘤效应。传统常规分割放疗模式是基于线性二次模型以及传统放射生物学的“4R”理论基础，对肿瘤细胞分次照射、分时段杀伤。肿瘤细胞周期再分布（redistribution）和再氧合（reoxygen）有利于促进照射对肿瘤细胞的杀伤，增进放疗效果；而肿瘤细胞再修复（repair）和再群体化（repopulation）有利于肿瘤细胞逃避射线的杀伤，消弱放疗效果。与传统分割的外放疗相比，BT 已被证明有潜在的治疗优势：1）BT 的剂量分布通常优于外放疗，提供了最高的生物等效剂量[5]；依据线性二次模型的预测，增加辐射剂量应该导致更多的肿瘤细胞死亡[6]，更有利于肿瘤特异性抗原的释放[7]。2）与外放疗的急性照射不同，BT 实现持续照射，可以累积杀伤更多被细胞周期再分布到辐射敏感期的肿瘤细胞[8]。3）LDR-BT 具有较低的氧增强比（oxygen enhancement ratio，OER），可能会规避低氧对肿瘤的放射保护作用。4）与其他放疗方式相比，BT 可能最适合保留正常组织和相关淋巴器官，避免辐射敏感的免疫细胞受到照射[2]。因此，BT 在启动“原位疫苗”效应时可能比传统外放疗更具优势[2，9]。

放射引起的DNA 损伤、氧化应激和细胞死亡是免疫系统的主要刺激物。BT 照射导致肿瘤细胞DNA损伤、细胞死亡，死亡的肿瘤细胞释放损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）的特定信号。氧化应激反应也会产生一些DAMPs。DAMPs 来自细胞膜、细胞质、细胞核和内质网，主要包括细胞高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）、热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）、钙网蛋白（calreticulin，CRT）、S100、氧化DNA、ATP等[10-11]。BT 后免疫原性主要依赖于DAMPs 的特定信号的释放[12]。其在细胞内均不诱发免疫应答，但被死亡细胞释放至细胞外，可以作为免疫性抗原，具有激活免疫应答的潜能。DAMPs 被结合或细胞质模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）、吞噬受体或清除受体、嘌呤受体等受体识别，诱导并激活树突状细胞（dendritic cells，DCs），吞噬死亡细胞，并将释放的肿瘤抗原传递给T 细胞；DAMPs 在这一过程中发挥关键的免疫原性作用[13]。BT 抗肿瘤免疫效应见图1。

图1 BT 抗肿瘤免疫效应

2 BT 促进DCs 和T 淋巴细胞的活化

DCs 的招募和活化，对启动抗肿瘤免疫效应至关重要[9，14]。BT 可以通过直接或间接地促进DCs 的活化、成熟[15]。BT 可诱导局部生成IFN-β，增强DCs 交叉抗原递呈的能力[16]，促进CD8+T 细胞的功能。DCs表面的受体识别并结合由BT 诱导释放的免疫性抗原启动DCs 的成熟、活化。BT 诱导生成的DAMPs 中的一些分子可以与DCs 表面的Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）及其他相关受体结合，如CRT、ATP 和HMGB1 分别与DCs 细胞表面的CD91、P2RX7 和TLR 4 结合，热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）与TLR4 和CD91 结合，氧化DNA 可与TLR9结合等。TLRs 通过NF-κB、AP-1 以及IFN 家族，促使DCs 的成熟，如TLR4 激活髓样分化一级反应基因88（MyD88）信号通路，导致NF-κB 易位，促进DCs 成熟[17]。DCs 的活化过程中重要的是上调主要组织相容性复合体（histocompatibility complex，MHC）Ⅱ类分子的表达，诱导CD80、CD86 和CD40 的表达，生成Ⅰ型IFN、IL-1、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子[18]。补体C3a 和C5a 的释放亦可作为刺激DCs 的成熟的替代途径[19]。

成熟的DCs 将诱导效应T 细胞的分化。DCs 识别抗原，并将之提呈给T 细胞，CD4+T 细胞增殖为CD8+T 淋巴细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK），从而活化细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）和NK 细胞[20]。成熟DCs 上表达的共刺激配体CD80 和CD86 与T 细胞表面的共刺激受体CD28 结合，刺激细胞因子IL-2 的产生，IL-2是T 细胞扩增的重要细胞因子。其他在成熟DCs 中上调的共刺激配体，如ICAM-1 与T 细胞表面的LFA-1结合[21]，CD40 配体与CD40 结合在活化CD4+T 辅助细胞中发挥重要作用，亦有助于活化CD8+T 细胞。若在没有DCs 释放共刺激信号和细胞因子的情况下，MHC 肽复合物与T 细胞受体的相互作用不会导致T细胞扩增，而是导致T 细胞耐受。效应T 细胞可以进入放射肿瘤和放射部位之外的病灶，导致远处肿瘤的消退。

细胞因子水平变化也是激活免疫应答的重要机制之一[22]。BT 通过DCs 的成熟、活化介导了CTLs活化，并释放多种趋化因子和细胞因子。CTLs 释放TNF-α、诱导干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，这些细胞因子进一步活化CTLs，并触发CD4+T 细胞向CTLs极化[23]，且这些细胞因子能够抑制调节性T 细胞（regulatory T cells, Tregs）和骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）[24]。作为抗原提呈细胞的巨噬细胞也可以被这些细胞因子激活，辐射能够将起抑制抗肿瘤作用的M2 型巨噬细胞转化为促进抗肿瘤效应的M1 型巨噬细胞[25]，发挥抗肿瘤免疫效应。另一方面，BT 还可以通过影响免疫相关基因的表达，启动抗肿瘤免疫效应。HDR-BT 显著诱导免疫检查点相关基因的变化，包括编码PD-L2、TIM-3、B7-H3、PD-L1、CTLA-4、GITR、BTLA 和CD40 的基因；IFN-γ 表达相关基因上调（如CXCL9、PD-L1、STAT1 和PSMB10），同时与CD8+T 细胞浸润、积聚和活化相关的基因表达上调（如CD8A、TIGIT、Lag3、CD27、CCL5 和CXCR6）[26]。BT 抗肿瘤免疫效应相关分子及信号通路见图1，表1。

表1 BT 抗肿瘤免疫效应相关分子及信号通路

3 BT 调节淋巴细胞亚群

3.1 LDR-BT 调节T 淋巴细胞亚群

T 淋巴细胞大量浸润是细胞免疫发挥抗肿瘤反应的核心，也是免疫治疗发挥作用的细胞学基础，BT 能够诱导T 淋巴细胞亚群的活化。LDR-BT 治疗的前列腺癌患者外周血中活化的T 淋巴细胞亚群的比例显著增加，且Tregs 和MDSCs 的比例显著降低[27]。LDR-BT 后，外周血中CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、NK细胞（CD3-CD16+/56+）等免疫活性细胞均显著升高[4]，活化的T 淋巴细胞（CD3+HLA-DR+、CD4+HLA-DR+和CD8+HLA-DR+）比例亦逐渐升高[27]；虽然CD8+T 淋巴细胞百分比无显著变化[4]，但是CD4+/CD8+比值显著升高[4]，活化的T 淋巴细胞和Tregs 的比例也逐渐增加[27]。与初始CD4+T、CD8+T 淋巴细胞相比，LDRBT 开始后记忆性CD4+T、CD8+T 细胞显著减少；且3 个月后外周血中CD8+T 淋巴细胞和NK 细胞呈明显降低趋势，可能因为在某些细胞因子的作用下，上述免疫细胞迁移至肿瘤微环境，诱发细胞免疫[4，27]。Tregs 和MDSCs 的减少可能与活化T 细胞亚群的增加有关[27]。在LDR-BT 开始后，Tregs 亚群的比例显著增加，相对于CD4+和CD8+T 细胞亚群的比值无明显变化；而在200 天后观察到Tregs 与活化的CD4+和CD8+T 细胞亚群的比值显著降低。同样的还有MDSCs（CD11b+CD14+HLA-DR-）亦是在200 天后观察到显著降低。

B 淋巴细胞在抗肿瘤免疫效应中既可以作为抗原递呈细胞（antigen-presenting cells，APCs），也可分泌抗体介导肿瘤细胞杀伤效应。LDR-BT 后外周血中B 细胞（CD3-CD19+）的比例呈明显的下降趋势，可能是因为B 细胞由于抗原识别而从外周血迁移到受照射的肿瘤微环境而减少[27]。但是，另一项研究表明外周血中的B 细胞不受LDR-BT 影响，但是体现B 细胞免疫功能的免疫球蛋白IgM、IgG 和IgA，以及补体C3 和C4 的浓度均在特定的时间内显著升高[4]。

3.2 HDR-BT 调节淋巴细胞亚群

HDR-BT 导致肿瘤内剂量具有异质性，且不同剂量区出现不同的免疫效应[2]。在临近粒子源的中心区域，越靠近放射源剂量越高，高剂量区（＞12 Gy）表现出最大程度的免疫原性肿瘤细胞死亡和肿瘤特异性抗原的释放[7]。随着距离的增加，照射剂量逐渐跌落，在高-中剂量（8～12 Gy）可以最佳地诱导细胞质释放dsDNA 和cGAS/STING/干扰素γ，驱动肿瘤细胞免疫标志物的表型改变[28]。中等剂量（2～5 Gy）可增强免疫刺激细胞因子的释放，导致免疫细胞增强肿瘤浸润。由巨噬细胞释放的T 细胞刺激细胞因子IL-12和抑制细胞因子IL-10 具有剂量依赖和剂量率依赖性效应，本效应在此剂量区域达到峰值；与之相似的还有转化生长因子-β，其可调节内皮黏附分子ICAM-1 和VCAM 的表达，增强肿瘤组织的免疫细胞浸润。低剂量（＜2 Gy）可能通过对辐射高度敏感的细胞群的直接细胞毒性作用，使局部肿瘤浸润淋巴细胞亚群暂时消失，因此这也提供了一个重新构建没有免疫抑制细胞的微环境的机会[2]。

HDR-BT 对免疫细胞的影响呈剂量依赖性。单次剂量2 Gy 时，CD8+CTL 细胞无显著变化，而随着剂量的增加，CD8+T 细胞的募集增加；剂量达10 Gy 时，CD8+CTL 细胞显著增加，达到峰值；之后随着剂量的增加，CD8+T 细胞反而减少。单次剂量10 Gy 对肿瘤浸润免疫细胞水平的变化影响最大，有效地提高了肿瘤浸润细胞毒性CD8+T 淋巴细胞的水平。同样，此剂量有效的抑制了M2 型巨噬细胞的募集[29]。

3.3 BT 联合免疫治疗

放疗联合免疫治疗在提高肿瘤局部控制率，激活机体免疫应答、克服常规放疗介导的免疫耐受等方面具有明显优势。相对于外放疗，BT 是否具有同样的优势，目前研究尚显不足。Xia 等[30]通过动物模型证明，免疫治疗增强BT 的局部肿瘤控制率。Sui 等[31]报道了BT 联合免疫治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察，局部病灶均呈明显消退。Yuan 等[32]观察到经过HDR-BT 和免疫治疗的前列腺癌患者，局部组织内PD-L1 表达量增多，CD8+T 细胞显著增多，而外周血中CD4+效应T 细胞也显著升高。Rodriguez-Ruiz 等[3]同样证实了免疫治疗能够增强BT 的远隔效应。目前一些有关BT 联合免疫治疗的前瞻性临床试验正在进行中，如NCT04395079、NCT04620603、NCT02642-809、ChiCTR2000038689、ChiCTR2100044382、ChiCTR2000039748 等，上述研究将进一步揭示两者联合治疗的临床效果和具体机制。

4 结语与展望

动态的抗肿瘤免疫反应一般包括以下步骤：肿瘤细胞凋亡或死亡后释放肿瘤免疫性抗原；DCs 捕获这些免疫性抗原，发育成熟并迁移到区域淋巴结；DCs将捕获的抗原递呈给T 细胞并活化T 细胞；活化的T细胞迁移、渗透至肿瘤组织内，然后识别、杀伤肿瘤细胞；被杀伤的肿瘤细胞继续释放免疫性抗原，形成“肿瘤-免疫循环”。虽然，BT 对机体免疫系统的影响尚缺乏深入的研究，但有研究已经表明，BT 杀伤肿瘤细胞，逐渐破坏肿瘤组织，保留了肿瘤蛋白和肿瘤相关抗原的完整，调节免疫活性[4]，将“冷”肿瘤转化为免疫活性更强的“热”组织，启动抗肿瘤免疫效应，涉及的机制包括免疫原性肿瘤细胞死亡，抗原交叉递呈及T 淋巴细胞的活化。

BT 因其高度适形性及提供更高生物效应剂量的优势，诱导肿瘤细胞免疫原性死亡和肿瘤特异性抗原的释放，进而激活抗肿瘤免疫效应。但是，目前的研究尚有不足之处：1）BT 诱导的抗肿瘤免疫效应并不能完全抑制肿瘤的复发、转移和进展，尚需与其他治疗方法联合，BT 诱导抗肿瘤免疫效应的复杂机制将局部治疗转变为全身治疗，联合免疫治疗或成为肿瘤治疗学的一大突破[33-35]。2）影响BT 后免疫应答的相关因素并不明确，不同剂量、持续时间、原发肿瘤病灶等因素对免疫应答的影响也不明确。3）BT 诱导抗肿瘤免疫效应的具体的机制尚不明确，有待进一步的研究。