基于UHPLC-Q Exactive轨道肼高分辨质谱分析八珍方化学成分

林慧敏，任强强，许 文，3，黄鸣清，3*

（1.福建中医药大学附属第三人民医院，福建 福州350108；2.福建中医药大学药学院，福建 福州350122；3.福建省中药学重点实验室，福建 福州350122）

八珍方为中医传统方剂，最早记载于明代陈实功《外科正宗》中，为清朝宫廷补益之成方，有健脾和胃、益气生血、肥儿消疳等功能。本方主要由参苓白术散加减而成，方中党参健脾益肺，养血生津；山楂配伍麦芽，行气消食、化浊降脂；薏苡仁配伍白扁豆，利水渗湿、健脾止泻；山药、芡实和莲子配伍，补脾养胃、益肾固精；茯苓配伍白术，健脾益气、利水渗湿；莲子配伍茯苓，亦有宁心安神的功效。组方配伍合理，平和温补，不寒不热，可治疗因脾胃虚弱所致的食少难消、腹痛便溏、面黄肌瘦，具有补而不滞、燥而兼润、补而不腻之特点［1］。临床研究表明，该方对幼老体弱及病后体虚、脾胃虚弱的患者尤为有效［2］；可治疗脾虚型小儿营养不良，具有补虚消积之功［3］；可改善食欲不振，胃纳减少的儿童脾虚厌食症状［4-5］，亦可治疗小儿疳积［6］。药理研究表明，该方具有增强胃肠蠕动，调节胃酸pH值，促进胆汁分泌，增加抗疲劳及耐缺氧能力的作用［1］。

八珍方现代研究多集中于临床及药理研究，化学成分研究仅表明此方中含有较多的人体必需微量元素［4，7］，不足以达到对该复方进行综合质量控制的目的。本实验采用超高效液相色谱-四级杆／静电场轨道阱高分辨质谱技术，通过与化学成分数据库比对，根据对照品化合物质谱的碎片离子信息，并结合相关文献报道的裂解规律，对八珍方中化学成分进行鉴定分析，为其药效物质基础阐明以及临床应用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国Agilent technologies公司）；BSA124S-CW型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；PS-60AL台式超声波清洗器（深圳市雷德邦电子有限公司）；JXFSTPRP-24型研磨仪（上海净信科技有限公司）；Heraeus Fresco17离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Q Exactive Orbitrap高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；明澈D24 UV纯水仪（美国Merck Millipore公司）。

1.2 试药 甲醇、乙腈（LC-MS级，德国默克公司）；甲酸、乙酸铵（LC-MS级，德国默克公司）；水为超纯水（Merck Millipore公司）；内标：L-2-氯苯丙氨酸（批号：103616-89-3，纯度≥98%，上海恒柏生物科技有限公司）；对照品：阿魏酸、紫铆素、儿茶素、鞣花酸、牡荆素、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、原儿茶醛、没食子酸、咖啡酸、没食子酸乙酯、芹菜素、千层纸素A、山奈酚、木犀草素、槲皮素、苔黑酚葡萄糖苷、1-咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、蔓荆子黄素、根皮苷、木犀草苷、槲皮苷、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、芦丁、水仙苷购自成都曼思特生物科技有限公司，供定性鉴定用；八珍方中药流浸膏来源于国药控股星鲨制药（厦门）有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 UPLC分析色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；正离子模式：流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），负离子模式：流动相为5 mmol／L乙酸铵水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序均为（0～1.0 min，1%B；1.0～8.0 min，1%B～99%B；8.0～10.0 min，99%B；10.0～10.1 min，99%B～1%B；10.1～12.0 min，1%B）；流速：0.5 mL／min；进样量：1 μL。

2.1.2 质谱条件Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱采用电喷雾离子源正、负离子两种模式。喷涂电压：3.8 kV（正离子模式）和3.1 kV（负离子模式），毛细管温度：320℃，鞘气流速（Arb）：45 psi，辅助气体流量（Arb）：15 psi，一级质谱分辨率（Full ms resolution）：70 000，二级质谱（MS／MS）分辨率：17 500，质荷比窗口宽度（TopN）：3，碰撞能梯度（NCE模式）：20、40、60 eV，扫描速率：7 Hz。质谱测定数据采用全扫描模式采集，数据采集范围m／z 70～1 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品：阿魏酸、紫铆素、儿茶素、鞣花酸、牡荆素、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、原儿茶醛、没食子酸、咖啡酸、没食子酸乙酯、芹菜素、千层纸素A、山奈酚、木犀草素、槲皮素、苔黑酚葡萄糖苷、1-咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、蔓荆子黄素、根皮苷、木犀草苷、槲皮苷、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、芦丁、水仙苷适量，加甲醇配置为10 μg／mL的对照品溶液供定性鉴别用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取八珍方中药流浸膏1.0 mL，移至5 mL量瓶内，用50%甲醇水稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即样品溶液。精密移取200 μL样品溶液至EP管中，加入2 μL内标，涡旋混匀30 s；样品在4℃以2 000 r／min离心15 min，将上清液转移到进样瓶中上机检测。

2.3 八珍方中药流浸膏化学成分的鉴定 八珍方中药流浸膏供试品溶液在“2.1”项色谱-质谱条件下进行分析，UPLC-Q-Exactive四级杆轨道阱高分辨率质谱正负离子模式下的总离子流图见图1、图2。化学成分的鉴定方法：首先，根据供试品的高分辨率质谱总离子流色谱峰，提取化合物精确分子质量信息，运用Xcalibur 3.0软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）在质量偏差小于5 ppm的范围内计算其可能的元素组成。其次，以一级质谱获取的分子离子峰作为母离子，进行碰撞诱导解离（CID）二级质谱分析，获得相应化合物的碎片离子。根据化合物的质谱裂解途径，结合对照品和相关文献的报道，最终鉴定化合物91个，其中33个化合物经与对照品比对确定，结果见表1。

图1 八珍方中药流浸膏样品UHPLC-Q Exactive轨道肼高分辨质谱的正离子流图

图2 八珍方中药流浸膏样品UHPLC-Q Exactive轨道肼高分辨质谱的负离子流图

2.3.1 有机酸和酚酸类 由表1可见，共鉴定有机酸和酚酸类11种。现以绿原酸为例，根据多级碎片信息，解析八珍方中药流浸膏酚酸类成分的质谱裂解规律。在所建立的化学成分数据库中绿原酸的分子式为C16H18O9，通过Compass Isotope Pattern模拟软件计算其负离子模式下精确分子质量为353.087 3［M-H］-。一级质谱在负离子模式下给出分子离子峰为m／z 353.087 7［M-H］-，质量偏差Error为1.18 ppm，故初步推测其为绿原酸或其异构体。

表1 八珍方中药流浸膏化学成分鉴定

该分子离子峰进行碰撞诱导解离，获得的二级碎片离子有m／z 191、179、173、161、135，根据其化学结构和二级碎片信息，推断m／z 191离子碎片是由母离子m／z 353.087 7［M-H］-失去一个咖啡酰基所致，m／z 173离子碎片是由m／z 191进一步失去一分 子H2O所 致。m／z 179离 子 碎 片 由 母 离 子m／z 353.087 7［M-H］-失去一个奎宁酰基所致，而m／z161和m／z 135离子碎片是由m／z 179分别进一步失去一分子H2O和CO2所致。其质谱裂解途径见图3，并且其色谱保留时间、分子离子峰和二级质谱碎片与绿原酸对照品完全一致。综上，该化合物结合对照品和文献［21］进行比对，鉴定为绿原酸。

图3 酚类裂解途径（以绿原酸为例）

续表1

2.3.2 黄酮类 由表1可见，共鉴定黄酮类43种。现以槲皮苷为例，根据多级碎片信息，解析八珍方中药流浸膏黄酮类成分的质谱裂解规律。在所建立的化学成分数据库中槲皮苷的分子式为C21H20O11，通过Compass Isotope Pattern模拟软件计算其负离子模式下精确分子质量为447.092 7［M-H］-。一级质谱在负离子模式下给出分子离子峰为m／z 447.093 6［M-H］-，质量偏差Error为2.01 ppm，故初步推测其为槲皮苷。

该分子离子峰进行碰撞诱导解离，获得的二级碎片离子有m／z 301、300，根据其化学结构和二级碎片信息，推断m／z 301离子碎片是由母离子m／z 447.093 6［M-H］-失去一分子鼠李糖基（-Rha）所致，m／z 300离子碎片是由m／z 301进一步失去一个氢原子所致。其质谱裂解途径见图4，并且其色谱保留时间、分子离子峰和二级质谱碎片与槲皮苷对照品完全一致。综上，该化合物结合对照品和文献［22］进行比对，鉴定为槲皮苷。

图4 黄酮类裂解途径（以槲皮苷为例）

2.3.3 炔类 由表1可见，共鉴定炔类成分4种。现以党参炔苷为例，根据多级碎片信息，解析八珍方中药流浸膏炔类成分的质谱裂解规律。在所建立的化学成分数据库中党参炔苷的分子式为C20H28O8，通过Compass Isotope Pattern模拟软件计算其负离子模式下精确分子质量为441.176 1［M+HCOO］-。一级质谱在负离子模式下给出分子离子峰为m／z 441.176 6［M+HCOO］-，质量偏差Error为1.17 ppm，故初步推测其为党参炔苷。

该分子离子峰进行碰撞诱导解离，获得的二级碎片离子有m／z 305、215、185、159、179，根据其化学结构和二级碎片信息，推断m／z 305离子碎片是由母离子m／z 441.1766［M+HCOO］-失去一个-C7H6基团所致。m／z 179离子碎片是由母离子m／z 441.176 6［M+HCOO］-氧己环母核上失去-C14H16O5基团所致。m／z 215离子碎片是由母离子失去氧己环母核-C6H12O6基团所致，而m／z 185和m／z 159离子碎片是由m／z 215分别进一步失去-CH2O和-C3H4O基团所致。其质谱裂解途径见图5，并且其色谱保留时间、分子离子峰和二级质谱碎片与绿原酸对照品完全一致。综上，该化合物结合对照品和文献［23］进行比对，鉴定为党参炔苷。

图5 炔类裂解途径（以党参炔苷为例）

2.3.4 三萜类 由表1可见，共鉴定三萜类成分3种。现以茯苓酸B为例，根据多级碎片信息，解析八珍方中药流浸膏三萜类成分的质谱裂解规律。在所建立的化学成分数据库中茯苓酸B的分子式为C30H44O5，通过Compass Isotope Pattern模拟软件计算其负离子模式下精确分子质量为483.311 0［M-H］-。一级质谱在负离子模式下给出分子离子峰为m／z 483.311 5［M-H］-，质量偏差Error为1.09 ppm，故初步推测其为茯苓酸B。

该分子离子峰进行碰撞诱导解离，获得的二级碎片离子有m／z 465、409、365，根据其化学结构和二级碎片信息，推断m／z 465离子碎片是由母离子m／z 483.311 5［M-H］-失去一分子H2O所致。m／z 409离子碎片由母离子m／z 483.311 5［M-H］-失去一个丙酸基-C3H6O2所致，而m／z 365离子碎片是由m／z 409进一步失去一分子CO2所致。其质谱裂解途径见图6。综上，该化合物结合文献［20］进行比对，鉴定为茯苓酸B。

图6 三萜类裂解途径（以茯苓酸B为例）

2.3.5生物碱类由表1可见，共鉴定生物碱类成分12种。现以莲心碱为例，根据多级碎片信息，解析八珍方中药流浸膏生物碱类成分的质谱裂解规律。在所建立的化学成分数据库中莲心碱的分子式为C37H42N2O6，通过Compass Isotope Pattern模拟软件计算其正离子模式下精确分子质量为611.312 1［M+H］+。一级质谱在正离子模式下给出分子离子峰为m／z 611.310 2［M+H］+，质量偏差Error为-3.17 ppm，故初步推测其为莲心碱。

该分子离子峰进行碰撞诱导解离，获得的二级碎片离子有m／z 579、504、283、206、107，根据其化学结构和二级碎片信息，推断m／z 579离子碎片是由母离子611.310 2［M+H］+失去一个-CH3OH基团所致。m／z 504和m／z 107离子碎片由母离子在对甲基苯酚位置裂解所致，而m／z 283和m／z 206离子碎片是由母离子分别在碳-氧键和碳-碳键处断裂所致。其质谱裂解途径见图7。综上，该化合物结合文献［24］进行比对，鉴定为莲心碱。

图7 生物碱类裂解途径（以莲心碱为例）

2.3.6 内酯类 由表1可见，共鉴定内酯类成分7种。现以白术内酯Ⅱ为例，根据多级碎片信息，解析八珍方中药流浸膏内酯类成分的质谱裂解规律。在所建立的化学成分数据库中白术内酯Ⅱ的分子式为C15H20O2，通过Compass Isotope Pattern模拟软件计算其正离子模式下精确分子质量为233.154 1［M+H］+。一级质谱在正离子模式下给出分子离子峰为m／z 233.153 5［M+H］+，质量偏差Error为-2.44 ppm，故初步推测其为白术内酯Ⅱ。

该分子离子峰进行碰撞诱导解离，获得的二级碎片离子有m／z 187、159、145、131、105、91，根据其化学结构和二级碎片信息，推断m／z 187峰为［M+H-CH2O2］+，m／z 159和m／z 145离子碎片是由m／z 187分别进一步失去-C2H4和-C3H6基团所致。m／z 187峰进一步失去-C4H8、-C2H2和-CH2基团，则获取m／z 131、105和91的离子碎片，其质谱裂解途径见图8。综上，该化合物结合文献［20］进行比对，鉴定为白术内酯Ⅱ。

图8 内酯类裂解途径（以白术内酯Ⅱ为例）

3 讨 论

Q Exactive MS系统具有高通量的扫描和多重检测能力，尤为擅长目标定量实验。快速交替的正负极扫描模式支持最复杂的分析方法，在节约实验时间的同时，能得到高质量质谱图和化合物精确分子量，为复杂体系提供高度可靠的定性和定量测试结果，已广泛应用到药物代谢组学、蛋白质组学、中药化学成分分析以及毒理学等研究领域［25］。本试验利用该法对八珍方中药流浸膏中化学成分进行分离和鉴定，通过获得色谱峰准分子离子，对八珍方中药流浸膏进行了化学成分分析，12 min完成化合物的分离，鉴别出91种八珍方可能含有的化学成分，包括11种有机酸和酚酸类成分、43种黄酮类、4种炔类、3种三萜类、12种生物碱类和7种内酯类成分，其余包括内酰胺和氨基酸类等成分。其中炔类成分主要来自党参，三萜类主要来自茯苓，生物碱类主要来自于莲子，内酯类成分主要来自白术，黄酮类成分主要来自山楂和薏苡仁，所鉴别出的化合物能够很好地表征八珍方的特征化学物质基础。

本试验利用UHPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS联用技术，建立对八珍方中药流浸膏化学成分快速有效的系统鉴定方法，对八珍方中化学成分进行全面、快速的分析，将为控制八珍方制剂质量及阐明其作用机制提供科学依据，并且为中药及其复方的物质基础研究提供一种快速、有效的分析方法。