氨基酸分析法测定抗HPV功能性妇科敷料中β-乳球蛋白的含量

【作 者】张晓萌，傅俊，王康俊，王巨才

海南省药品检验所，海南省药物质量研究重点实验室，海口市，570216

0 引言

近年来，国家药品监督管理局和各省级药品监督管理局陆续批准了多批抗HPV生物蛋白敷料的生产许可，此类抗HPV生物蛋白敷料是通过生物蛋白敷料预防和阻断生殖道HPV感染，用于宫颈癌前病变（CIN）及宫颈癌的临床治疗。抗HPV生物蛋白敷料经临床验证，在单独和联合治疗高危型HPV感染时获得的转阴率和有效率均优于保妇康栓、重组人干扰素等早期上市产品，能够有效降低宫颈癌的发病率，使用期间无明显不良反应，可作为抗高危型HPV感染的首选用药[1-8]。

抗HPV生物蛋白敷料为第二类医疗器械，主要成分为生物蛋白、卡波姆、防腐剂等。生物蛋白是抗HPV生物蛋白敷料中阻断HPV感染的有效成分，来源于牛乳、羊乳中的乳清蛋白，是利用现代工艺技术从乳制品中提取的一类蛋白质，具有抗癌、免疫调节、提高记忆力等作用[9]。β-乳球蛋白占乳清蛋白总量的44%～50%，是乳清蛋白的主要生物活性成分。因此，准确检测抗HPV生物蛋白敷料中的β-乳球蛋白含量，对测定抗HPV生物蛋白敷料中的有效成分含量，完善其质量标准，确保产品的有效性具有重要意义。

目前，β-乳球蛋白常用的检测方法主要有凝胶电泳法（SDS-PAGE）[10]、毛细管电泳法（CE）[11-12]、反相高效液相色谱法（RPHPLC）[13]、超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法（LC-MS/MS）[14]和二喹啉甲酸试剂盒法（BCA）[15]等。上述检测方法在检测周期、检测成本、操作过程等方面都存在一定缺陷。笔者应用氨基酸分析法，在酸性条件下将β-乳球蛋白水解为游离氨基酸，采用阳离子交换色谱分离，茚三酮柱后衍生，采集570 nm波长下色谱图，通过测定水解获得的赖氨酸含量，间接测定样品中β-乳球蛋白的含量[16-18]。经验证，采用笔者建立的检测方法，酸性条件下裂解β-乳球蛋白共得到赖氨酸等12种氨基酸，将测得的各氨基酸加和，与实际称量的β-乳球蛋白标准物质蛋白含量基本一致，说明该实验方法可以将β-乳球蛋白完全裂解为游离氨基酸并通过柱后衍生法测得[19]。

1 材料

1.1 仪器与试剂

S4300型氨基酸分析仪（Sykam公司）；XS205型电子天平（Mettler-Toledo公司）；ED23型电热干燥箱（Binder公司）。

1.2 药品与试剂

抗HPV生物蛋白敷料（海南众康悦医疗器械有限公司，批号:20200601、20200602、20200603、20200801、20200802、20200803，规格：0.1 mg/g）；β-乳球蛋白对照品（Sigma-Aldrich 公司，批号：SLCF 4944，纯度≥99.7%）；流动相A和流动相B均购自Sykam公司；盐酸（西陇科学股份有限公司，分析纯）；水合茚三酮（上海麦克林生化科技有限公司，分析纯）；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用阳离子交换色谱柱（LCA K06/Na柱，4.6×150 mm）；流动相：流动相A（称取柠檬酸三钠11.9 g、柠檬酸6 g、苯酚1 g，置于1 L量瓶中，加适量水溶解，再加65 mL甲醇和6 mL浓盐酸，加水定容，调pH至3.4）；流动相B（称取柠檬酸三钠11.9 g、氢氧化钠2.8 g、苯酚1 g、硼酸5 g，置于1 L量瓶中，加水溶解并定容，调pH至10.8），采用梯度洗脱（0～2.5 min，100%A；2.5～11 min，100%→85% A；11～17 min，85%→80% A；17～23.3 min，80%→67% A；23.3～30.4 min，67%→20% A；30.4～45.1 min，20%→0 A）；衍生液（茚三酮溶液）流速0.25 mL/min；检测波长：570 nm；柱后反应器温度130 ℃；进样量：50 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

精密称取β-乳球蛋白对照品20 mg，置20 mL顶空瓶中，加6 mol/L盐酸溶液5 mL，充氮密封，置105 ℃下裂解24 h，取出放置至室温，将所得溶液用1 mol/L盐酸溶液完全转移至100 mL量瓶中，并稀释定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

精密称取抗HPV生物蛋白敷料样品2.0 g，置20 mL顶空瓶中，加6 mol/L盐酸溶液5 mL，充氮密封，置105 ℃下裂解24 h，取出放置至室温，将所得溶液用4 mol/L氢氧化钠溶液完全转移至10 mL量瓶中，并稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果如图1所示。结果表明，在570 nm波长处，对照品溶液中的赖氨酸和其他相邻氨基酸分离良好。

图1 对照品溶液典型色谱图Fig.1 Typical chromatogram of reference solution

2.4 线性关系考察

精密称取β-乳球蛋白对照品适量，以1 mol/L盐酸溶液定量稀释成每1 mL含β-乳球蛋白（77.28、135.24、193.20、251.16、309.12）μg的系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别精密量取50 μL注入氨基酸分析仪，记录色谱图中赖氨酸相应色谱峰面积。以赖氨酸的峰面积（y）为纵坐标、β-乳球蛋白浓度（x,μg/mL）为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程y=5.060x+4.278（r=0.999 7）。结果表明，β-乳球蛋白检测浓度线性范围为77.28～309.12 μg/mL。

2.5 检测限和定量限

按“2.1”项下色谱条件进样50 μL，记录峰面积并计算β-乳球蛋白浓度，当信噪比为3时检测限为0.1 μg/mL；当信噪比为10时定量限为2 μg/mL。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件注入氨基酸分析仪，连续进样6次，测定峰面积。结果表明，峰面积的RSD=0.55%（n=6），仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液，分别于室温（20～25℃）下放置（0、1、2、6、8、12）h按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录赖氨酸峰面积，按外标法计算样品中β-乳球蛋白的含量。结果，β-乳球蛋白含量的RSD=1.1% (n=6)，表明供试品溶液12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取同一批号样品适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算含量。结果，β-乳球蛋白平均含量为0.114‰,RSD=0.51% (n=6)，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取抗HPV生物蛋白敷料的空白辅料共9份，分别置于50 mL量瓶中，分别加入低、中、高浓度（处方量80%、100%、120%）的β-乳球蛋白对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果如表1所示。

表1 加样回收率实验结果（n=9）Tab.1 Results of recovery test（n=9）

2.10 样品含量测定结果

精密称取6批（20200601、20200602、20200603、20200801、20200802、20200803）样品和对照品适量，分别按“2.2.1”、“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液和对照品溶液，再分别按“2.1”项下色谱条件注入氨基酸分析仪，记录赖氨酸峰面积，按外标法以峰面积计算样品中β-乳球蛋白含量，测得样品中平均含量为0.115‰、0.114‰、0.118‰、0.116‰、0.113‰、0.115‰。

3 讨论

3.1 最佳酸性水解条件

因为蛋白质样品在酸水解过程中会造成氨基酸不同程度的破坏，不同的水解温度和时间对氨基酸含量的测定有一定影响，笔者考察了不同酸性水解条件下（水解温度为105、110 ℃，裂解时间为16 h、20 h、24 h、28 h）β-乳球蛋白对照品的回收率，结果见表2。考虑到酸水解对氨基酸的破坏，排除回收率超过100%的水解条件，选择最接近100%的105 ℃、24 h作为本次实验的水解条件。

表2 最佳酸性水解条件考察Tab.2 Study on optimum acid hydrolysis conditions

3.2 标志氨基酸的选择

取β-乳球蛋白进行酸性水解后得到多种游离氨基酸，在570 nm处可检测到门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸共12种氨基酸，综合灵敏度、分离效果及专属性等多种因素，最终选定以赖氨酸作为标志氨基酸进行定量测定。

3.3 与其他方法的比较

目前，β-乳球蛋白常用的检测方法主要有凝胶电泳法（SDS-PAGE）、毛细管电泳法（CE）、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法（LCMS/MS）和二喹啉甲酸试剂盒法（BCA）等。抗HPV功能性妇科敷料中β-乳球蛋白的含量为0.1‰，因此对定量分析方法的灵敏度、精密度等提出了更高的要求。取6批样品（20200601、20200602、20200603、20200801、20200802、20200803）和对照品各适量，进行含量测定，结果显示，SDS-PAGE 法和CE 法的定量限较高，不能满足该产品定量分析的要求；RP-HPLC法处理步骤较为繁琐，分离度和专属性较低；LCMS/MS法，灵敏度高、选择性好，检测成本较高，精密度和重复性不及RP-HPLC法；BCA法，灵敏度高、选择性好，重复性欠佳。结果如表3所示。

表3 样品含量测定Tab.3 Determination of the content of sample

氨基酸分析法与上述几种检测方法比较，操作简单、专属性强、准确率高、重复性好，通过对样品方法学研究，结果显示，该方法适合于抗HPV功能性妇科敷料中β-乳球蛋白的定量分析。