基于生物信息学方法分析MUC1基因在卵巢癌中的表达及意义

林少冲，徐丽达，杜俊鹏，王凯，王宝金

(1.郑州大学第三附属医院 妇科，河南 郑州 450052；2.河南省卵巢恶性肿瘤国际联合实验室，河南 郑州 450052；3.同济大学附属第一妇婴保健院 转化医学研究中心，上海 201204)

卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、易转移、复发率高和高度耐药等恶性生物学行为[1-2]。手术切除及术后辅助化疗使部分卵巢癌患者从中获益，但是卵巢癌患者的5 a总体生存率仍不理想[3]。近年来，靶向治疗及免疫治疗在多种肿瘤治疗中展现出巨大的优势，如PD-1抑制剂可以阻断免疫检查点PD-1，激活免疫系统产生肿瘤免疫应答，已用于癌症治疗中[4]。MUC1在临床研究和肿瘤基础研究领域一直备受关注。本研究旨在分析MUC1在卵巢癌中的表达水平及意义，为以MUC1为靶点的卵巢癌免疫治疗策略提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 GEPIA数据库筛选条件如下。(1)“gene: MUC1”。(2)“Expression DIY: Boxplot”。(3)“Datasets selection: OV”。检索MUC1转录组水平变化。

1.2 HPA数据库利用人类蛋白图谱数据库(the human protein atlas，HPA)比较卵巢癌组织和正常卵巢组织中MUC1蛋白表达情况。

1.3 LinkedOmics数据库检索步骤如下。(1)cancer type database：卵巢癌TCGA数据集。(2)data type：mRNA expression(RNA seq)。(3)选择基因MUC1并应用pearson correlation test分析，得到与ESPL1正负相关的基因。(4)进行GSEA分析(GO生物功能和KEGG通路富集分析)。将得到的正负相关基因进行Cmap分析寻找潜在小分子药物。

1.4 Kaplan-Meier 生存分析利用Kaplan-Meier Plotter 数据库进行生存分析。筛选条件如下。(1)“Cancer：Ovarian Cancer”。(2)“Gene：MUC1”。(3)“Survival：OS和FPS”。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件处理数据。卵巢癌组织与正常组织表达差异的比较，采用t检验。MUC1表达与卵巢癌预后的关系采用Kaplan-Meier生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MUC1基因在肿瘤中的表达概况首先，利用GEPIA数据库探究MUC1基因在33种常见肿瘤中的表达情况。如图1所示，MUC1在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸润癌(BRCA)、宫颈鳞癌和腺癌(CESC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、胶质母细胞瘤(GBM)、低级别胶质瘤(LGG)、胰腺癌(PAAD)、胸腺癌(THYM)和子宫内膜癌(UCEC)中表达明显升高；肾上腺皮质肿瘤(ACC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、肺鳞癌(LUSC)、皮肤黑色素瘤(SKCM)和睾丸癌(TGCT)中MUC1基因表达水平明显降低。

图1 MUC1基因在33种常见肿瘤中的表达情况

2.2 MUC1在卵巢癌中的表达GEPIA数据库中比较了426个卵巢癌组织和88个正常卵巢组织的MUC1mRNA水平。肿瘤组织中MUC1表达明显高于正常组织，见图2A。同时，MUC1的异常高表达在GSE18520数据集得到了再次验证，见图2B。通过HPA数据库中的免疫组化数据，探索MUC1蛋白的表达情况。图2C和图2D使用相同的抗体染色，但是染色的强度和质量明显不同。癌组织中检测到较高的表达强度，但在正常卵巢组织中未检测到MUC1蛋白的表达。

2.3 MUC1与卵巢癌患者预后的关系Kaplan-Meier生存曲线显示，MUC1高表达患者的无瘤进展生存时间(18.6个月)明显短于MUC1低表达的卵巢癌患者的无瘤进展生存时间(22个月)(P<0.05)。但是MUC1高表达组与低表达组患者的总体生存时间比较，差异无统计学意义(P=0.15)，见图3B。

临床分期Ⅰ期和Ⅱ期卵巢癌患者的亚组中，MUC1的表达与预后无关，见图3C。但是临床分期Ⅲ期和Ⅳ期的卵巢癌患者的亚组中， MUC1低表达组患者总生存时间明显长于高表达组(P<0.05)，见图3D。与此类似的是，亚组分析显示，TP53基因突变是影响患者预后的危险因素(HR=1.35)。突变组中MUC1基因高表达患者预后较差，但在TP53基因野生型亚组中，MUC1表达与预后无关。见图3E、3F。

A.GEPIA数据库中MUC1 mRNA水平；B.GSE18520数据集中MUC1 mRNA表达水平；C、D.HPA数据库中卵巢癌和正常卵巢组织MUC1蛋白免疫组织化学结果

A.无瘤进展生存时间；B.总体生存时间；C.Ⅰ期和Ⅱ期亚组；D.Ⅲ期和Ⅳ期亚组；E.TP53突变型；F.TP53野生型。

2.4 MUC1在卵巢癌中的生物学功能分析LinkedOmics数据库探索了MUC1引起卵巢癌患者预后较差的潜在分子机制。GO富集分析显示MUC1与细胞免疫密切相关，参与了适应性免疫反应、体液免疫反应等免疫相关生物学过程。同时，KEGG通路富集分析发现MUC1与Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路和TNF信号通路等癌症相关信号通路相关，见表1。LinkedOmics数据库中miR-503、miR-499、miR-154和miR-29a等在卵巢癌中可能靶向MUC1，起负向调控作用，见表2。

表1 卵巢癌中MUC1及其密切相关基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.5MUC1的潜在治疗价值Pearson相关分析结果显示，MUC1与ELF3、HTR3A、LCN2、CFB及APOL1等表达呈正相关，与MEST、SALL2、TET1、SMO和C10orf82等表达呈负相关，见表3。基于MUC1正负相关基因，CMap分析结果显示，褪黑素、纳多洛尔和甲苄肼为对卵巢癌具有潜在治疗价值的3种小分子药物，并在PubChem数据库中获取了上述3种药物的二维和三维结构，见图4。

表2 对MUC1表达具有负性调控作用的miRNA

表3 MUC1最正和最负相关的5个基因

A.褪黑素；B.纳多洛尔；C.甲苄肼

3 讨论

MUC1黏蛋白是一种属于黏蛋白家族的Ⅰ型高度糖化跨膜蛋白，对黏膜起润滑、保护作用，并且在上皮更新与分化及维持上皮完整性等方面起重要作用[5]。MUC1基因是一种癌基因，研究发现，其在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、甲状腺癌和肝癌中呈现出过表达的状态，并且表达水平与肿瘤恶性程度相关[6-7]。本文从基因表达、临床预后、调控机制等多角度、多层面探究了MUC1在卵巢癌中的表达和临床意义，为寻找可靠肿瘤标志物和了解卵巢癌恶性过程提供新思路。

MUC1基因表达紊乱，在多种肿瘤类型中普遍存在。Jing等[8]证实MUC1在乳腺癌中异常高表达，且可作为乳腺癌潜在预后和治疗靶点。还有学者指出，MUC1蛋白着色强度在增生活跃的癌细胞中更明显，提示MUC1的表达量随病情加重而增加。对大样本数据进行Kaplan-Meier生存分析发现，MUC1高表达患者的无瘤进展时间明显短于低表达患者。进一步的亚组分析发现，高临床分期及TP53突变患者的预后与MUC1的表达密切相关。TP53基因编码p53蛋白，监测细胞的分裂，能影响细胞进行DNA修复，修复失败后激活下游基因使细胞凋亡，发挥抑制肿瘤作用[9]。临床分期高及TP53基因突变都是卵巢癌患者预后的高危因素，推测MUC1可能加速卵巢癌的恶性进展使患者的生存时间缩短。

近年来，MUC1在肿瘤免疫领域受到越来越多的关注。有研究表明，MUC1可以通过和肿瘤微环境中的免疫细胞相互作用促进肿瘤细胞的免疫逃逸[10]，MUC1参与到适应性免疫、T细胞介导的免疫反应和抗原的处理和呈递等多种免疫过程。通路富集分析显示，MUC1与NF-κB、TNF等细胞信号通路密切相关。有研究发现，MUC1可以帮助肿瘤细胞抵抗TNF相关凋亡诱导配体引起的细胞损伤，参与肿瘤细胞的免疫逃逸，加速癌症的恶性进程。另外，MUC1可以与NF-κB、p65和转录因子TWIST等形成复合物，诱导活化EMT相关蛋白的表达，促进EMT进程[11]。MUC1胞外区域的抗MUC1单克隆抗体正在成为包括乳腺癌在内的多种癌症的治疗手段[12]。鉴于MUC1在肿瘤免疫和癌症相关通路中的关键作用，MUC1有望成为卵巢癌免疫治疗的新靶点。

本研究结果显示，miR-512-5p等miRNA与MUC1存在负性调控关系，与相关研究结果一致[13]。褪黑素和甲苄肼等小分子药物可以抑制MUC1的表达，对卵巢癌具有潜在的治疗价值。褪黑素是松果体分泌的内源性药物，具有抗癌作用，如调控细胞周期、促进细胞凋亡、抗血管生成、抗炎和抗氧化，还能调节各种免疫系统内细胞和细胞因子[14]。甲苄肼是一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，现主要应用于霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤等多种癌症的治疗中[15]，其抗卵巢癌作用有待于进一步揭示。这些miRNA及小分子药物的应用将为卵巢癌治疗提供新思路。

综上所述，本研究通过多数据的联合应用，多层次、多角度地分析了MUC1在卵巢癌恶性进程中的作用，MUC1基因在卵巢癌中异常高表达并与患者预后不良相关，有希望成为卵巢癌靶向治疗的新靶点。