CCR7与SELL在宫颈鳞状细胞癌中的表达及临床意义

安崇佑 赵奕暄 刘彩艳

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一。宫旁侵犯及淋巴转移是其主要转移途径，与治疗、预后密切相关。早期宫颈癌(Ⅰ～Ⅱ期)治愈率可达80%，而Ⅲ期患者治愈率可达60%[1]。复发和转移是宫颈癌主要的致死原因。随着对人乳头瘤病毒(human papillomaviruses,HPVs)与宫颈癌发病之间的关系的研究逐步深入，免疫微环境的改变在HPVs致宫颈癌的过程中具有举足轻重的作用。因此，由于免疫发生是一个极为复杂的过程，故势必有众多免疫相关因子在各个环节扮演着不同的角色，找出其中起关键作用的因子理论上可以在早期阻断、辅助治疗及预防复发三个层面均起到至关重要的作用，实现早发现、早治疗、早预防，或可进一步提高宫颈癌的治愈率。本研究应用UALCAN数据库对相关性筛选功能，对TCGA中305例宫颈癌样本进行筛选，筛选出对宫颈鳞状细胞癌患者的预后具有显著影响的潜在生物标志物。同时，对不同分期的宫颈鳞状细胞癌患者的基因表达情况、CCR7和SELL基因共表达情况和生存曲线进行比较和分析，探索宫颈鳞状细胞癌的潜在生物标志物，为宫颈恶性肿瘤的快速诊断和精准治疗奠定坚实的基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 用以分析SELL和CCR7表达关系的305例宫颈鳞癌患者数据均来自UALCAN平台(http://ualcan.path.uab.edu)。UALCAN是一个基于互联网的交互式网络平台，可以用于分析来源于TCGA的转录组和临床数据。

1.2 方法 通过UALCAN在线工具可以得到肿瘤患者组织中基因的表达情况、共表达情况和生存分析等信息，包括箱线图、基因热图和生存曲线[2]。

2 结果

2.1 CCR7和SELL 在宫颈鳞癌中的表达情况 宫颈癌患者组的CCR7和SELL基因的表达水平均高于正常对照组。同时，在不同分期的宫颈鳞状细胞癌患者组中，CCR7和SELL的表达随分期进展出现先升高后降低的过程，基因表达的高值出现在Stage2、Stage3两个阶段。其中SELL的表达在正常对照组和Stagel的比较，差异有统计学意义(P=0.026)，其余各组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表1、2。

图1 CCR7和SELL 在正常对照组和宫颈鳞癌患者组中的表达情况；a CCR7在正常对照组和宫颈鳞癌患者组中的表达情况；b SELL在正常对照组和宫颈鳞癌患者组中的表达情况；c CCR7在正常对照组和不同分期宫颈鳞癌患者组中的表达情况；d SELL在正常对照组和不同分期宫颈鳞癌患者组中的表达情况

表1 CCR7和SELL 在正常对照组和宫颈鳞癌患者组中的表达情况

表2 CCR7和SELL在正常对照组和不同分期宫颈鳞癌患者组中的表达情况

2.2 CCR7和SELL 在宫颈鳞癌中表达的相关性 显示SELL与CCR7在宫颈鳞癌中的表达具有较强的正相关性(r=0.84)。SELL高表达的宫颈癌患者，其CCR7表达水平也相对较高，SELL 低表达患者，其CCR7的表达水平也较低。从CCR7和SELL 在宫颈鳞癌中表达相关性热图可以得知，CCR7和SELL位列彼此显著相关的基因列表的第一和第二位，反映了这两个基因之间紧密的共表达关系。这种基因之间的相关性在发挥生物学功能方面很可能存在密切的联系。除了CCR7和SELL外，CD6、LY9、IL16、CD27和CD48等基因也存在着较为紧密的互作关系，但它们之间的相关程度低于CCR7和SELL。见图2。

图2 CCR7和SELL 在宫颈鳞癌中表达的相关性结果；a、b CCR7和SELL 在宫颈鳞癌中表达的相关性曲线；c、d CCR7和SELL 在宫颈鳞癌中表达相关性热图

2.3 CCR7和SELL表达水平与宫颈鳞癌患者预后的关系 CCR7和SELL表达水平与宫颈鳞癌患者生存曲线，从图中可以看出，CCR7高表达组的生存情况优于低表达组，SELL高表达组的生存情况优于低表达组，差异均有统计学意义(P<0.01)。由此可见，CCR7和SELL高表达患者相较于低表达患者有更好的生存预期，反映了CCR7和SELL与宫颈鳞癌患者的生存有着潜在的联系。见图3。

图3 CCR7和SELL表达水平与宫颈鳞癌患者生存曲线;a CCR7表达水平与宫颈鳞癌患者生存曲线；b SELL表达水平与宫颈鳞癌患者生存曲线

3 讨论

宫颈癌作为妇科三大恶性肿瘤之一，仍严重威胁着无数女性生命。早期宫颈癌术后病理并不总是符合“理想情况”，一些特殊的病理表现仍提示着可能潜在的转移可能，比如肿瘤大小、浸润深度以及脉管内癌栓等，因此Sedlis标准应运而生。于是对于具有病理高风险的患者，追加放化疗常作为补充治疗以期达到降低复发、改善预后的目的。

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一个生物信息学中常用的可以有效筛选和分析癌症信息的平台，主要是基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的癌症数据构建的，它可以帮助科研人员实现对相关基因的生物标志物鉴定、表达谱分析和生存分析等功能[3]。TCGA(The cancer genome atlas，癌症基因组图谱)由 National Cancer Institute(NCI，美国国家癌症研究所)和 National Human Genome Research Institute(NHGRI，美国国家人类基因组研究所)于 2006 年联合启动的项目，收录了各种人类癌症(包括亚型在内的肿瘤)的临床数据，基因组变异，mRNA表达，miRNA表达，甲基化等数据，是癌症研究者很重要的数据来源。通过UALCAN平台对TCGA数据的整合分析，研究人员可以获得基因表达分析、共表达分析和生存分析等数据分析结果，提升了肿瘤生物学研究的工作效率和研究结果的可靠性。

SELL(L-selectin，CD62L)是Ⅰ型跨膜凝集素受体，是选择素家族成员之一，表达于绝大多数循环白细胞表面的细胞黏附分子。SELL最著名的作用为诱导T细胞归巢，并且通过多种通路发挥抗肿瘤作用，在多种恶生肿瘤动物模型中，CD62L+T细胞比CD62L-T细胞可以更高的控制肿瘤细胞的生长[4，5]。然而，最近H.Angharad Watson等人研究发现，L-Selectin控制实体肿瘤细胞生长并不是来自于对T细胞的归巢作用，而是通过激活肿瘤内部的治疗性T细胞实现的[5]。这一发现为研究SELL在恶性肿瘤中的作用提供了新的角度与思路。

CCR7(C-C chemokine receptor 7)属于G蛋白偶联受体家族，通常表达于T细胞亚组中央记忆细胞(T-cell subset central memory cell)、胸腺T细胞、B细胞和成熟树突状细胞。CCL21和CCL19成组型表达于淋巴管起始及淋巴结中，常出现于基质细胞和高内皮小静脉。文献显示，CCL19和CCL21二者刺激CCR7可诱导G蛋白活性、EKR 1/2信号通路、钙动员以及细胞移行[6]。CCR7/CCL21轴的过表达主要与肿瘤细胞淋巴结转移有关[7]。同时，CCR7与包括多重恶性肿瘤进展相关，CCR7高表达往往意味着更大的肿瘤体积以及更深的组织侵犯。这一点与宫颈癌的临床病理分期标准相契合。

然而，放化疗的副反应、副损伤目前愈来愈受到重视，在生存率提高已达到瓶颈的今天，提高生存质量可以从另一方面为患者带来的巨大收益。尽量避免不必要的放化疗是提高生存治疗的重要途径之一。Sedlis不可否认在一定程度上解决了补充治疗的问题，但此单纯从局部病理结果推测患者潜在淋巴转移风险仍存在一定不足。如果可以从循环系统中寻找可靠的生物标志物，多角度、多层次评估转移、复发的风险，将能够更加准确、可靠。

近年来，最新研究证实了通过检测循环中SELL水平来发现肿瘤的可行性[8]。虽然SELL在宫颈癌中表达情况研究较少，但其在大肠癌、肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤中表达的研究相对较成熟，武欣等[9]对大肠癌患者不同组织中SELL表达情况进行对比，发现大肠癌组织SELL表达明显高于癌旁正常组织，同时，伴有淋巴转移者SELL表达水平会进一步升高。在肺癌中同样有类似的实验结论[10]。而在妇科肿瘤中亦有人关注SELL的作用，相关研究证实了卵巢癌术前、术后以及术后复发、未复发患者血清中SELL水平的差异具有显著性[11]，从而一定程度上证明了其在妇科恶性肿瘤中的潜在意义。

另一方面，CCR7在宫颈癌形成及淋巴转移中也起着至关重要的作用。高危型人乳头瘤病毒(human papillomaviruses,HPVs)感染是宫颈癌最主要的致病因素。随着近年来研究逐渐深入，人们发现HPV感染的细胞会主动改变免疫微环境[12，13]，通过抑制树突状细胞CCR7的诱导作用，损害淋巴结归巢趋化因子，进而影响到相应适应性免疫反应的发生。有研究发现，CCR7在伴有淋巴转移的宫颈癌组织中呈现明显高表达[14]。有研究也发现CCR7与肿瘤的淋巴细胞转移密切相关[15]。本研究中发现，对于宫颈癌患者CCR7总体呈高表达，然而通过不同宫颈癌分期对实验组分层比较后不难看出，CCR7表达在宫颈癌Ⅰ期和Ⅱ期呈明显递增趋势，宫颈癌Ⅲ期患者则升高减缓甚至略有下降趋势，而在Ⅳ期患者中则明显下降。虽然宫颈癌被人为分成4个大的期别，然而宫颈癌发生发展的过程是连续的。最初自发的免疫增强作用和宫颈癌免疫抑制作用尚可相互制衡，但随着疾病进展，此消彼长，最终实现免疫逃避。

同时，SELL的表达情况与CCR7类似，但不同的是SELL在Ⅳ期宫颈癌患者中仍有较高表达，甚至在宫颈癌Ⅰ～Ⅳ期中变化不是很大。这说明了二者作用途径的差异。有学者提出SELL控制实体肿瘤细胞生长并不是来自于对T细胞的归巢作用，而是通过激活肿瘤内部的杀伤性T细胞实现的[7]。这一观点或许可以解释本研究结果，宫颈癌以实体肿瘤为主，可激活的内部杀伤性T细胞理论上应与肿瘤体积呈正比，所以，宫颈癌恶化可能无法严重影响来自肿瘤内部的潜在杀伤力。这一假设仍需要进一步研究证实。因此，CCR7和SELL有望成为宫颈癌复发监测及预后评估的有效新指标，而且可能成为免疫治疗的新靶点。

再者，CCR7和SELL在宫颈鳞癌患者组织样本中表达上调在宫颈癌不同分期中差异的相似性，提示CCR7和SELL在存在一定的互作关联，反映了机体对两种基因在表达水平上的协同调节，与此相关的调控机制和通路值得进一步研究。除了分子水平的表达上调和基因互作，CCR7和SELL在机体表征方面也表现出对生存预期的影响，提示CCR7和SELL可能作为判断宫颈鳞癌患者生存时间和生存质量等预后情况的重要标志物，这也印证了之前讨论中的判断。二者均具有临床和科研应用价值。

最后，已有学者提出慢性炎症会影响肿瘤的生长[16]。同时，免疫治疗作为新的替换治疗方案，在临床上已经在多种恶性肿瘤的治疗上已经取得了较明显效果。免疫抑制剂单药治疗复发难治性宫颈癌具有较好的安全性，但总体缓解率仍偏低。SELL作为细胞黏附因子，可以诱导T细胞归巢作用，并增强肿瘤细胞内的T细胞的杀伤作用，达到控制肿瘤细胞生长的目的[7]，而CCR7在肿瘤免疫微环境改变中起着至关重要的作用，对实现肿瘤进展的早期阻断有重要意义。

综上所述，本研究通过对UALCAN数据库中对宫颈鳞状细胞癌患者的预后具有显著影响的基因的分析，筛选出对疾病的诊断和治疗具有潜在价值的生物标志物。结果显示，SELL和CCR7的高表达均能明显改善宫颈癌患者生存率，因此，它们有可能成为控制宫颈癌发展、转移的药物治疗的关键靶点，并为宫颈恶性肿瘤的防治提供新的思路和借鉴。