贵腐菌的筛选鉴定及培养条件优化

王超萍，刘凡启，严战伟，尹向田*，丁燕*

（1.山东省葡萄研究院/山东省葡萄栽培与精深加工工程技术研究中心，山东济南 250100；2.山东新丰农业开发股份有限公司，山东威海 264500；3.北京张裕爱斐堡国际酒庄有限公司，北京 101500）

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），属半知菌纲，丛梗孢目，丛梗孢科，葡萄孢属，是产生贵腐作用的病原菌[1]。该菌的寄生范围比较广[2]，可以侵染200多种植物的不同组织，对农业生产有较大危害[3-4]。在葡萄贮存中，灰葡萄孢菌繁殖速率快，变异率高，适应性强[5]，造成的损失最为严重[6]。2013年10月，美国加州大学金海翎教授发现灰霉菌是世界上首个可以利用小分子RNA达到有效侵染的病原菌，由此开启了一个新的研究方向[7]。

葡萄果实成熟期间，在夜间迷雾湿度大而白天晴朗干燥的干湿交替条件下，贵腐菌才能对葡萄果实发生适度侵染，导致果实在树体上天然浓缩。贵腐菌在侵染过程中改变了葡萄的新陈代谢，刺激果实产生一些次生代谢产物，进一步丰富了葡萄的风味物质，使酿成的贵腐酒有别于其他甜葡萄酒，具有独特的风味。

乳山位于山东半岛东南部，地处北纬36°41′～37°08′，东经121°11′～121°51′，属暖温带东亚季风型大陆性气候，四季变化和季风进退较明显。但与同纬度的内陆相比，具有气候温和、雨水丰沛、光照充足、无霜期长的特点。该地以砂质壤土为主，透气性好，排水容易，极有利于葡萄生长。独特的小气候造就了乳山葡萄酒特有的产区风格，也为贵腐菌的侵染提供了可能。

由于气候条件对天然贵腐作用的发生起着关键影响，除了欧洲传统的优质贵腐酒产区外，世界上其他酿酒葡萄产区很难在自然条件下使葡萄发生贵腐作用，因此贵腐酒非常珍贵，目前国内没有批量生产。

Caseys等[8]为了揭示灰葡萄孢的寄主特异性和致病性的遗传结构，对灰葡萄孢在整个植物界的侵染结果进行分析，从8种寄主植物的90种基因型上，生成98株灰霉病菌的传染性矩阵，结果表明主要是由寄主抗性或病原体毒力的变化所解释。兰圆圆等[1]利用从感染灰霉菌的番茄果实、青菜豆果实和叶子上分离得到了灰葡萄孢菌，并成功进行了人工侵染得到贵腐葡萄；安荣艳等[9]报道‘霞多丽’贵腐酒研究采用的菌种选自感染了灰霉病的果蔬染病组织，通过不同条件下灰葡萄孢菌种的β-葡萄糖苷酶酶活的测定与比较，最终选定编号为Botrytis-T的菌株作为人工贵腐葡萄的侵染使用菌株；汪蕾等[10]在贺兰山东麓贵腐葡萄特征研究中，从‘威代尔’葡萄上分离得到菌株，经过光学显微镜观察灰葡萄孢为表层侵染，确定其是造成感染的微生物；黄露莉等[11]研究的人工贵腐‘玫瑰蜜’葡萄酒采用的菌种是从‘夏黑’葡萄果实上分离得到，经形态学和分子鉴定为灰葡萄孢。此外，也有研究人员对灰葡萄孢在不同条件下的生长情况进行对比分析，杨玉红等[12]调查了不同碳源、pH、光照、温度条件对菌种的影响，得出灰霉菌在以下条件生长发育较快：马铃薯＋葡萄糖培养基，pH5～6、18～26 ℃，每天给予8 h的光照。李宁等[13]探索了在摇瓶液体培养条件下，不同碳源、氮源和无机盐对灰葡萄孢液体深层培养的影响，确定了最佳培养基组成为葡萄糖3%、土豆汁4%、硝酸钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%；最佳培养条件为温度26 ℃、pH 5.5、转速120 r/min。在乳山田间试验观察到晚收的酿酒葡萄‘贵人香’果实表面前期为黑褐色，呈皱缩甚至干瘪状态，但果肉完好未腐烂，表现出典型的“贵腐”特征，因此采样作为研究对象进行筛菌鉴定，并研究菌株的最佳培养条件。该研究将为中国贵腐酒的研制及其菌种分子生物学研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳山台依湖酒庄10月底11月初的晚摘感染贵腐病害的酿酒葡萄‘贵人香’。

培养基有PDA培养基、PSA培养基、葡萄汁琼脂培养基（自制）、葡萄枝条琼脂培养基（自制）、MEA麦芽汁琼脂培养基、PDA改良培养基（1/2PDA＋1/2MEA）；主要试剂为葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麦芽糖、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、麦芽浸膏、尿素、胰蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、硝酸钠。以上培养基、试剂均购自济南赛傲生物技术有限公司。真菌基因组DNA提取试剂盒：Omega，D3390；DNA纯化回收试剂盒：购自天根生化科技（北京）有限公司，DP214；引物：由生工生物工程股份有限公司合成，按照合成单加入ddH2O，制成10 μmol溶液。

1.2 主要仪器与设备

无菌打孔器：购自济南赛傲生物技术有限公司；光学显微镜：意大利Optika；菌种分离超净台：苏净安泰。

1.2 方法

1.2.1 贵腐菌的筛选

采用常规组织分离方法[11]。选取感染贵腐菌病的酿酒葡萄‘贵人香’，用无菌挑针选取葡萄表皮感染贵腐菌的病健交接组织，大小约为3 mm×3 mm，用75%的酒精消毒30 s，再用无菌水冲洗3次，用无菌镊子将挑取的组织置于PDA培养基上，铺平，27 ℃下培养3～5 d。从分离的菌落中挑选具有典型性状的无杂菌菌落重新接种到PDA平板上。相同温度条件下，继续培养3～5 d。如此反复，直至菌落形态一致时保留分离出的菌株，并将其保存在PDA培养基中。

1.2.2 贵腐菌的鉴定

菌落形态学观察：将纯化好的菌种选取3株，取单菌落接种至改良PDA[14]培养基上，于27 ℃下培养3 d，观察单菌落、菌丝形态、生长速度、颜色等特征变化，使用十字交叉法测定并记录菌落直径大小。

菌丝及孢子形态学观察：在400倍显微镜下观察菌株分生孢子形态。

贵腐菌的分子生物学鉴定[15]：使用真菌DNA小量提取试剂盒D3390提取DNA，用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'进行PCR扩增，PCR产物使用普通琼脂糖凝胶DNA试剂盒回收。产物委托青岛派森诺基因科技有限公司进行测序，将得到的ITS rDNA序列用NCBI Blast程序与NCBI ribosomal RNA sequence数据库中的数据进行比对，利用MEGA 4.0软件绘制系统发育树[16]。

1.2.3 贵腐菌培养基的选择

培养基的选择：选用PDA培养基、PSA培养基、葡萄汁琼脂培养基、葡萄枝条琼脂培养基、MEA麦芽汁琼脂培养基、PDA改良培养基（1/2PDA＋1/2MEA）进行对比试验。使用打孔器在供试菌落边缘打取菌饼[17]，然后将菌饼用挑针转接到6种不同的培养基上，在27 ℃条件下培养3 d，使用十字交叉法测定并记录菌落大小，3次重复。

碳源的选择：以改良的PDA为基础培养基，分别选用1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麦芽糖、果糖代替PDA培养基中的碳源，其他操作同培养基筛选，3次重复。

氮源的选择：以改良的PDA为基础培养基，分别选用1%的牛肉膏、酵母粉、酵母膏、麦芽浸膏、尿素、胰蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、硝酸钠代替PDA培养基中的氮源，其他操作同培养基筛选，3次重复。

pH选择：以改良PDA为基础培养基，用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH调整pH，梯度分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11。制成不同的pH梯度的平板分别接菌，其他操作同培养基筛选，3次重复。

温度的选择：以改良PDA为基础培养基，分别在4、10、15、20、25、30、35 ℃下进行培养，其他操作同培养基，3次重复。

光照的选择：在25 ℃条件，改良的PDA为基础培养基，3个菌株在无光照、光照、光照及无光照时间各半的情况下培养，其他操作同培养基筛选，3次重复。

2 结果与分析

2.1 菌种的形态分析

2.1.1 灰葡萄孢的形态学鉴定

试验共分离到68株菌，选取3株疑似贵腐菌株的菌落进行培养。初期菌落灰白色，周围光滑、规则，后期菌丝变成鼠灰色，第7天孢子开始发芽，菌丝密集，气生菌丝发达，基内菌丝结成团，3～4 d后开始产生孢子。孢子头密布，边缘处密度较大，培养10 d开始形成菌核。菌核紧密贴生在培养基表面，圆盘形，灰黑色，大小为7 mm。在光学显微镜下观察到的菌株孢子形态如图1、图2、图3，孢子梗丛生，有隔膜，孢子呈球形或者椭圆形，单胞，通过对比《真菌鉴定手册》[18]，初步鉴定为灰葡萄孢。

图1 菌株1菌落及孢子形态Figure 1 Colony and spore morphology of strain 1

图2 菌株2菌落及孢子形态Figure 2 Colony and spore morphology of strain 2

图3 菌株3菌落及孢子形态Figure 3 Colony and spore morphology of strain 3

2.2 贵腐菌的分子生物学鉴定

利用通用引物ITS1/ITS4对菌株1、菌株2、菌株3的ITS rDNA片段进行扩增，经测序获得目的基因片段分别为526 bp、503 bp、510 bp，经Blast搜索并与GenBank数据库中的核酸序列进行同源性比较，建立系统发育树。发现3株菌株均与灰葡萄孢的基因序列同源性相近，同源率在99.23%以上。挑选亲缘性较高的同属不同种的菌株作为参比菌株，并采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 4.0构建系统发育树。结果表明，菌株1、菌株2、菌株3分别与参比菌株B.cinereaZ17 KC172064.1、B.cinereaLW6 MN077161.1、B.cinereaQ1 MT704983.1同源性相近。结合形态特征鉴定结果，可将3株菌鉴定为B.cinerea，分别命名为GRX06、GRX08、GRX62（图4）。

图4 基于ITS rDNA序列构建的贵腐菌和相关真菌的系统发育树Figure 4 Phylogenetic tree of B.cinerea and related fungi based on ITS rDNA sequence

2.3 菌种培养基的选择及培养条件的优化

2.3.1 培养基及其成分的选择

（1）基本培养基的选择。通过对3个菌株在6种不同培养基上的生长表现，根据3 d后菌落直径测量结果及柱状图（图5）可以发现，3株菌株在所选培养基上均可生长，但在PDA改良培养基上的生长情况最佳，菌落直径分别为6.78 cm、6.95 cm、7.06 cm。

图5 不同培养基对3株菌株生长情况的影响Figure 5 Effect of different culture media on three strains growth

（2）碳源的选择。通过对3株菌株在6种不同碳源的改良PDA培养基上进行培养，根据菌落直径的测量可以发现，3株菌株均能很好的利用这6种碳源，但对碳源优劣次序不同。GRX62的最佳碳源为甘露醇，菌落直径5.13 cm；GRX06的最佳碳源为葡萄糖，菌落直径4.47 cm；GRX08的最佳碳源为甘露醇，菌落直径4.22 cm（图6）。

图6 碳源对3株菌株生长情况的影响Figure 6 Effect of carbon sources on strains growth

（3）氮源的选择。通过对3个菌株在9种不同氮源的PDA改良培养基上进行培养，根据菌落直径可以发现，3株菌株在以尿素为氮源的培养基上几乎不生长，在其他氮源培养基上菌体生长正常，而且3株菌株的氮源优劣次序不同。GRX62最佳氮源为酵母粉，菌落直径为6.48 cm；GRX06的最佳氮源为牛肉膏，菌落直径为6.47 cm；GRX08的最佳氮源为硝酸钾，菌落直径6.35 cm（图7）。

图7 不同氮源对3株菌株生长情况的影响Figure 7 Effect of nitrogen sources on growth of three strains

（4）pH值优化。通过对3个菌株在9种不同pH培养基的培养，根据菌落直径的测量数据发现（图8），3株菌株在偏中性的培养基上均生长良好。GRX62和GRX08在不同的pH下均能生长，GRX06在pH为3、4的情况下基本不生长。GRX62的最佳pH为8，菌落直径为6.70 cm；GRX06的最佳pH为6，菌落直径为7.15 cm；GRX08的最佳pH为6，菌落直径为6.55 cm。

图8 不同pH对3株菌株生长情况的影响Figure 8 Effect of different pH on growth of three strains

2.3.2 培养条件的选择

（1）温度条件优化。对3菌株在7个温度处理下进行培养，根据培养基菌落直径的测量数据可以发现，温度低于4 ℃及高于35 ℃时，菌落几乎不生长。GRX62在温度为20 ℃时，菌落直径最大为6.47 cm；GRX62在25 ℃时，菌落直径最大为7.15 cm；GRX08在温度为25 ℃时，菌落直径最大为6.55 cm（图9）。

图9 不同温度对3株菌株生长情况的影响Figure 9 Effect of temperatures on growth of three strains

（2）光照条件优化。对3菌株在3种不同光照条件下进行培养，根据培养基菌落直径的测量数据可以发现，菌落大小变化不大，GRX62和GRX06的最佳光照时间均为全光照，菌落直径分别为6.47、6.15 cm；GRX08菌株在黑暗的条件下长得最好，菌落直径是5.91 cm（图10）。

图10 不同光照处理对3株菌株生长情况的影响Figure 10 Effect of illumination treatment on growth of three strains

3 讨论与结论

从乳山台依湖酒庄的疑似发生贵腐作用的晚收酿酒葡萄‘贵人香’上分离筛选出3株贵腐菌GRX62、GRX06、GRX08。通过形态学、生理生化及ITS rDNA鉴定，确定3株菌株均为贵腐菌（Botrytis cinerea）。试验结果表明，GRX62的最佳培养条件为：改良PDA培养基、碳源为甘露醇、氮源为酵母粉、pH为8、温度为20 ℃，光照时间72 h；GRX06的最佳培养条件为：改良PDA培养基、碳源为葡萄糖、氮源为牛肉膏、pH为6、温度为25 ℃，全光照；GRX08的最佳培养条件为：改良PDA培养基、碳源为甘露醇、氮源为硝酸钾、pH为6、温度为25 ℃，暗培养。试验中选出的培养基基本与金其荣[19]等研究得出的结论一样，均为改良PDA培养基。

试验中贵腐菌的生长温度及光照条件，与雷百战、张鹏等[20-21]的研究结果一致；最适pH值也与李廷刚等[22]的结果相同。对贵腐菌的生长条件进行探索，不仅有利于认识贵腐菌的生物学特性和发生特点，在与土壤碳、氮等利用关系方面也有重要意义[23]。

山东是中国葡萄酒产业基础最好的地区，拥有张裕、威龙、烟台长城等一线品牌和蓬莱、乳山酒庄集群等，也是中国葡萄酒产业发展的风向标。试验首次从台依湖酒庄的晚收‘贵人香’葡萄中筛选出可以酿造贵腐酒的菌种，将为葡萄贵腐菌的分子生物学研究提供基础材料，为推动胶东地区葡萄酒产业的健康发展，丰富葡萄酒产品类型有重要意义。