蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫产卵和繁殖的影响

许嘉麟，谈家金，郝德君

(南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)病又称松树萎蔫病，能造成松树快速枯萎死亡[1]。松材线虫病的原发地是北美洲，但近年来在亚洲流行，其中中国是遭受该病危害最严重的国家[2-6]。我国十多个省区的松树遭受该病危害而大面积死亡，据统计，现有6 000万hm2松林正面临着松材线虫病大流行的威胁[7]。多年来，人们采用多种方式对松材线虫病进行防治，方法大致可分为物理防治、化学防治、生物防治等。由于化学防治的快速有效，近年来灭杀松材线虫的化学药剂迅速兴起，目前市场上主要化学药剂有丰索磷、甲维盐可溶粒剂、涕灭威、呋喃丹和克线磷等[8]。如Lu 等[9]用低质量浓度(0.1 μg/mL)的阿维菌素苯甲酸盐对松材线虫进行毒性试验发现，松材线虫的产卵数、孵化率、运动频率和发育均受到显著抑制。然而，使用这些化学试剂进行防治的同时造成的环境污染、生态破坏不容忽视。因此，环境友好型生物防治方法中微生物应用于防治松材线虫病受到了广泛的关注[10]。

植物寄生线虫的生物防治主要通过引入从自然界中筛选的线虫天敌降低线虫的种群数量，或者通过生物所产生的代谢毒素杀死线虫[11]。其中杀线虫细菌(nematocidal bacteria)是线虫的一大类重要天敌，其生长快、易于培养，已经成为生物防治线虫新的方向[12-15]。如黄冰纷等[16]筛选出的C611，经鉴定为链霉菌属，其发酵液处理松材线虫7 d，线虫死亡率达85%，将C611发酵液进行分离纯化，确定其活性成分为呋喃酮(furaltadone);用质量分数0.1%呋喃酮纯溶液处理松材线虫5 d，死亡率达96%。目前研究较多的杀线虫细菌有芽孢杆菌属(Bacilllus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和巴氏杆菌属(Pasteurella)等[17-19]，其中芽孢杆菌的研究最为深广。李亮亮等[20]在湿地松(Pinuselliotti)上分离出1株杀线细菌蜡样芽孢杆菌(B.cereus) NJSZ-13菌株，研究发现该菌株的滤液处理线虫48 h后，线虫死亡率高达到100%，滤液分别稀释2、4和10倍后处理松材线虫，随稀释倍数的增加，培养滤液的杀线活性逐渐降低。使用105cfu/mL浓度的菌悬液处理线虫48 h后，线虫死亡率达81.5%。这表明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫有较强的毒杀作用。为进一步了解蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫的生防作用，笔者研究了其对松材线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖等方面的影响，从而为更深入地研究其杀线机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)取自南京林业大学森林病理实验室。

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株由南京林业大学森林病理实验室谈家金课题组[15]从南京中山陵湿地松分离得到，用于松材线虫生防细菌，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2016660。

松材线虫AMA3虫株分离自安徽省马鞍山的黑松，现保存于南京林业大学松材线虫虫株资源库。

NA固体培养基：牛肉膏 5 g/L，氯化钠 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.2～7.4。

NB培养基：牛肉膏 5 g/L，氯化钠 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，pH 7.2～7.4。

1.2 菌悬液、发酵液和发酵滤液的获得

将保存的蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株在NA平板上进行活化后接入NB培养基中，在28 ℃、200 r/min 条件下摇床培养24 h，于10 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，弃上清液，用等体积无菌水悬浮菌体，即为供试菌悬液。同样条件培养4 d，获得的摇培液即为发酵液。将摇培液于10 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，上清液即为发酵滤液。

1.3 无菌松材线虫卵的获得

采用贝尔曼法分离获得适量的松材线虫虫液，将线虫液和 30%(体积分数)过氧化氢按体积比1∶1的比例混合后静置10 min，于离心机中离心5 min(3 000 r/ min)，吸去上清液，留松材线虫液约 1.5 mL，继续加入0.02%(质量分数)的硫酸链霉素1.5 mL，混合均匀后静置5 min。加入无菌水洗涤线虫 3～5 次。最后保留约 2 mL虫液，在线虫操作台中移接到无污染的灰葡萄孢平板上用脂膜封口，放入25 ℃的恒温箱中培养3～5 d。继而在无菌条件下漏取线虫于离心管，吸取足量(约10 000条/皿)线虫至35 mm的培养皿中。产卵2～4 h后用高温灭菌的毛刷和无菌水除去线虫，保留皿底的虫卵。在45倍昆虫解剖镜下挑取5～10个卵于NA培养基上培养24 h，若NA培养基无细菌污染，即可确定获得无菌虫卵。

1.4 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫的杀线率测定

在无菌条件下，松材线虫虫株在灰葡萄孢上繁殖5 d 后，用无菌水将线虫从灰葡萄孢上洗下，置于60 mm培养皿中待其产卵。线虫产卵2～4 h 后，将虫体悬浮液倒掉后加入少量无菌水，放置于25 ℃培养箱中培养12～24 h，待卵孵化，将二龄幼虫吸到灰葡萄孢上培养5 d 后，采用贝尔曼漏斗法分离线虫，无菌水冲洗线虫3次，在2 mL离心管中加入50 μL虫液(含有1 000条线虫)，并在离心管中分别加入NJSZ-13菌株的菌悬液、发酵液及发酵滤液的原液(T1)、5倍稀释液(T5)和10倍稀释液(T10)各1 mL，其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×108cfu/mL。对照为无菌水和NB培养基，4个重复。分别在24和48 h后将离心管震荡使虫液均匀后吸取20 μL在显微镜下观察并统计已死线虫数和总线虫数，每个离心管数3次，求平均值计算杀线率，使用 SPSS 13.0 软件对数据进行分析，Excel制图。

杀线率=死虫数/总虫数×100%。

1.5 松材线虫产卵量的统计

在1.5 mL离心管中挑入10对雌雄4龄幼虫，并分别向离心管中加入菌悬液、发酵液和发酵滤液的原液(T1)、10倍稀释液(T10)、100倍稀释液(T100)各1 mL，其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×108cfu/mL。无菌水、NB培养基为对照。每处理4个重复，25 ℃下培养箱中培养 24 h后将离心管的卵液冲洗至皿底画有网格线的35 mm培养皿中，统计产卵量和已孵化的二龄幼虫，使用Excel制图和 SPSS 13.0 软件对数据进行分析。

1.6 松材线虫卵孵化率

无菌条件下，在皿底画有网格线的35 mm的小皿中加入100 μL卵液(约含400个卵)，处理组加入菌悬液、发酵液和发酵滤液的10(T10)、100(T100)和1 000(T1 000)倍稀释液各1 mL，其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×108cfu/mL。无菌水、NB培养基为对照。然后用无菌水加至2 mL，每处理4个重复，置于半径为5.0 cm，高为0.5 cm的大培养皿中，封口；25 ℃恒温箱中培养12、24、36 h，统计各皿的线虫数，计算其孵化率和相对抑制率，使用GraphPad Prism 8.0.1 软件对数据进行分析并作图。

孵化率=孵化的二龄幼虫数/原卵数×100%；

相对抑制率=(对照孵化线虫数-处理孵化线虫数)/对照孵化线虫数×100%。

1.7 松材线虫繁殖力

无菌条件下，将100 μL线虫液(含500条松材线虫)分别与100 μL NJSZ-13菌株菌悬液、发酵液、发酵滤液的原液(T1)、5倍稀释液(T5)和10倍稀释液(T10)混合接入60 mm培养皿的灰葡萄孢中，在25 ℃培养箱培养5 d，用贝尔曼法分离线虫并计数。其中菌悬液和发酵液的原液浓度为3×108cfu/mL，无菌水和NB培养基为对照，每处理4重复，使用GraphPad Prism 8.0.1 软件对数据进行分析并作图。

2 结果与分析

2.1 NJSZ-13菌株对松材线虫的杀线作用

由蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫24、48 h的杀线效果(图1A)可知，蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液、发酵滤液杀线效果较强，而菌悬液较弱；NJSZ-13菌株的发酵液、发酵滤液和菌悬液的原液和5倍稀释液的杀线效果与对照组相比差异极显著(P<0.01)。随着菌液稀释倍数的增加，杀线效果逐渐下降。随着处理时间的延长，杀线率提高。NJSZ-13菌株的发酵液和发酵滤液原液处理24 h后的杀线率即高达100%，而其菌悬液原液处理48 h后的杀线率仅为81.47%。稀释5倍的发酵滤液和发酵液处理48 h后，松材线虫死亡率仍分别高达86.58%和87.04%。

不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。There are extremely significant differences between different uppercase letters (P<0.01), significant differences (P<0.05) between different lowercase letters among treatments. The same below.图1 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫24、48 h的杀线效果和处理24 h的产卵量Fig.1 Killing effect of Bacillus cereus NJSZ-13 strain on B. xylophilus in 24 and 48 hours and its spawning number treated 24 hours

2.2 NJSZ-13菌株对松材线虫产卵量的影响

从蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫处理24 h的产卵量(图1B)中可以看出，蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液、发酵滤液和菌悬液均降低了松材线虫的产卵量，随着稀释倍数的增大，处理组的产卵量逐渐增多。发酵液、发酵滤液和菌悬液的原液处理后，松材线虫产卵量极显著地低于对照组(P<0.01)。当稀释10倍后，发酵液和发酵滤液仍极显著地低于对照，菌悬液与对照也有显著差异(P<0.05)。当稀释100倍后，菌悬液与对照的产卵数相差不大，而发酵液和发酵滤液与对照仍有显著差异。

2.3 NJSZ-13菌株对松材线虫卵孵化的影响

菌株NJSZ-13的10倍稀释液对松材线虫卵动态孵化的影响结果如图2A显示， 在12～36 h测试期间，菌悬液、发酵液和发酵滤液的孵化率一直低于无菌水对照和NB培养基对照。在12 h时，菌悬液与对照无菌水、发酵液和发酵滤液与对照NB培养基相比有极显著差异(P<0.01)，其孵化率分别为76.83%、94.75%、60.43%、62.59%和92.35%。在24 h时，菌悬液、发酵液和发酵滤液对松材线虫卵孵化有显著影响(P<0.05)，但3种处理之间差异不显著。在36 h时仅发酵液和发酵滤液处理的卵与对照有显著差异。

图2 NJSZ-13菌株10～1 000倍稀释液处理松材线虫卵后其孵化率的动态变化Fig.2 Dynamic changes of hatch ability of B. xylophilus eggs treated with 10-1 000 times dilution of NJSZ-13 strain

由NJSZ-13菌株的10倍稀释液处理松材线虫卵后其孵化率的动态变化(图2B)可知，菌株NJSZ-13的100倍稀释液对松材线虫卵的抑制作用远小于10倍稀释液。在12 h时，菌悬液处理的孵化率为84.68%，与对照无菌水无显著差异(P>0.05)，而发酵液和发酵滤液(79.55%、79.26%)相对于对照NB培养基来说，有显著性差异(P<0.05)。

由NJSZ-13菌株100倍稀释液处理松材线虫卵后其孵化率的动态变化(图2C)可以看出，在12～36 h的测试期间，各处理曲线无限靠近对照曲线，这表明菌株NJSZ-13的1 000倍稀释液对松材线虫卵孵化均无显著影响(P>0.05)。

2.4 NJSZ-13菌株对松材线虫繁殖力的影响

从蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫繁殖力的影响(图3)可以看出，NJSZ-13菌株的发酵液、发酵滤液、菌悬液均能不同程度地影响松材线虫的繁殖力。发酵液、发酵滤液和菌悬液的原液和5倍稀释液处理松材线虫后其繁殖力与对照组有显著差异(P<0.05)。用发酵液、发酵滤液和菌悬液的10倍稀释液处理松材线虫后，菌悬液对线虫繁殖力无明显的影响，发酵液和发酵滤液仍与对照有显著差异(P<0.05)。

图3 蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫繁殖力的影响Fig.3 Effect of Bacillus cereus NJSZ-13 strain on the reproduction of B. xylophilus

3 讨 论

近年来，利用细菌防治松材线虫的研究愈发深广。张婉君等[21]筛选出的1株蜡样芽孢杆菌JK-XZ3菌株，其发酵滤液具有高效杀线活性，发酵滤液4、8和20倍稀释液处理48 h后，松材线虫的校正死亡率分别为99.55%、88.32%和22.52%。曾丽琼等[22]用马尾松内筛选出的短小芽孢杆菌Z11-2菌株和G36菌株的培养滤液处理松材线虫24 h，松材线虫的死亡率分别达92%和89%，48 h后线虫消解率分别是87.4%和77.5%。彭双[23]筛选得到13株对松材线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌菌株，这些菌株的发酵上清液对松材线虫处理24 h后，杀线虫率均达到了100%。本研究发现蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液和发酵滤液对线虫的致死率在处理48 h后可达到100%，而菌悬液为81.47%。发酵滤液5倍和10倍稀释液处理48 h后，松材线虫死亡率分别达到91.79%和80.57%，菌悬液的5倍和10倍稀释液处理48h后，松材线虫死亡率分别达到77.64%和61.21%。表明该菌株的发酵滤液和菌悬液中都含有杀线物质。NJSZ-13菌株对线虫的毒性作用不只是直接杀死，也体现在对线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖力等多方面的影响。丁国春等[24]研究表明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilus)AR11菌株的菌悬液两倍、5倍稀释液和上清液的两倍稀释液均明显抑制南方根结线虫卵孵化, 菌悬液10倍稀释液和上清液5倍稀释液对卵的孵化有促进作用，但促进机理不明确。王贻莲等[25]发现蜡样芽孢杆菌BCJB01菌株上清液和菌悬液对番茄根结线虫2龄幼虫和即将孵化出2龄幼虫的卵均有完全致死作用。在本研究中发现，蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株的发酵液、发酵滤液和菌悬液均降低了松材线虫的产卵量，随着稀释倍数的增大，产卵量逐渐增多。发酵液、发酵滤液和菌悬液的原液处理后，松材线虫产卵量极显著地低于对照组。另外，NJSZ-13菌株的菌悬液、发酵液和发酵滤液均对松材线虫卵的孵化有抑制作用，且抑制强度与浓度呈正相关关系，与处理时间呈负相关关系，表明NJSZ-13菌株可能主要影响松材线虫卵孵化的时间，即推迟卵的孵化。线虫繁殖力是其产卵量、卵孵化率等各项指标的综合体现，实验发现，NJSZ-13菌株的发酵液、发酵滤液和菌体菌悬液均降低了松材线虫的繁殖力，这与文中繁殖力相关指标的测定结果相一致。李亮亮等[20]筛选并鉴定出的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)LYMC-3菌株和蜡样芽孢杆菌(B.cereus)NJSZ-13菌株对松材线虫有高效的拮抗作用，即两株菌滤液处理线虫48 h后，死亡率均达到100%，其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。用NJSZ-13菌株的105cfu/mL菌悬液浸渍松材线虫48 h后，线虫死亡率达81.5%。尹艳楠等[26]采用人工皮接法将松材线虫接种到两年生马尾松幼苗上，将20 mL浓度为4×108cfu/mL的发酵液、菌悬液和发酵滤液的10倍稀释液灌注到两年生马尾松根部，来比较蜡样芽孢杆菌不同发酵产物对松材线虫病的防治效果。结果表明，蜡样芽孢杆菌菌悬液对松材线虫病有一定的预防效果，达33%，发酵液和无菌发酵滤液不能对松材线虫病起到预防作用。本研究在李亮亮等[20]和尹艳楠等[26]的研究基础上，更加广泛地研究了NJSZ-13菌株对松材线虫的防治机制。

关于蜡样芽孢杆菌NJSZ-13菌株对松材线虫的致病机理还需进一步研究，依据前人和本研究的结果，在后续研究中应全面实现对松材线虫杀线物质和分子机制方面的研究，可继续探究以明确发酵液的具体杀线物质以及该物质的调控机制。