森林草莓糖基转移酶基因家族生物信息学及其表达分析

赵倩倩 宋艳红 宋盼 陈亚铎 李刚 赵霞 刘丽锋 周厚成

摘要：【目的】對森林草莓糖基转移酶基因（FvUGT）家族进行生物信息学分析及基因表达分析，为深入研究森林草莓UGT基因功能和探索UGT调控草莓果实发育及花色苷及品质形成提供理论依据。【方法】基于Phytozome数据库鉴定得出138个FvUGT基因家族基因，运用生物信息学方法分析其蛋白理化性质、基因结构、保守结构域和进化关系，并采用实时荧光定量PCR对UFGT候选基因在森林草莓（红果和白果2个类型）各组织（根、叶柄、叶和果实）中的表达量进行分析。【结果】FvUGT基因家族可分为12个类群（A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N），每个类群分别包含16、2、23、32、8、1、5、5、7、3、21和4个成员;染色体定位发现FvUGT基因家族成员在除2号染色体之外的其他染色体上均有分布，且分布不均;FvUGT基因内含子长度、外显子位置和数目在不同成员间均存在差异，FvUGT基因家族在进化过程中产生较强的分化。实时荧光定量PCR检测结果表明，FvUFGT70基因在森林草莓白果和红果的叶和叶柄中有较高表达;FvUFGT94基因在各组织中均有表达;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有较高表达;而FvUFGT95和FvUFGT96基因在果实中有表达，且显著高于其他组织（P<0.05，下同）。同时，在果实的小绿期、转色期和成熟期的表达表现为，成熟期FvUFGT33和FvUFGT95这2个基因在森林草莓红果类型的表达量显著高于白果类型。【结论】7个FvUFGT基因表现出明显的组织差异性，其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果实中有较高表达量，且在森林草莓红果类型表达量显著高于白果类型，故推测其在花色苷合成中发挥作用。

关键词： 森林草莓;糖基转移酶基因（UGT）家族;基因结构;基因功能;表达分析

Abstract：【Objective】In this study， bioinformatics analysis and gene expression analysis of Fragaria vesca glycosyltransferase gene（FvUGT） family were carried out to provide theoretical basis for the FvUGT gene function of F. vesca and the exploration of UGT regulation of fruit development and anthocyanin and quality formation of F. vesca. 【Method】Based on the Phytozome database， 138 FvUGT family genes were identified， bioinformatics methods were used to analyze the protein properties， gene structure， conserved domains and evolutionary relationships of these FvUGT genes， and using real-time fluorescence quantitative PCR method to analyze the expression profiles of UFGT candidate genes in various tissues（root， petiole， leaf and fruit） of F. vesca（red fruit and white fruit）. 【Result】The FvUGT gene family could be divided into 12 subfamilies（A， C， D， E， F， G， H， I， J， K， L and N）， each of which contained 16，2，23，32，8，1，5，5， 7，3，21 and 4 members. Chromosomal localization analysis revealed that the coding genes of 138 FvUGT genefamily members were distributed on all chromosomes except chromosome 2， and the distribution was uneven.  The FvUGT gene intron length， exon position and number were different among different members， and the FvUGT family had a strong differentiation in the process of evolution. qRT-PCR found that the FvUFGT70 gene was highly expressed in leaves and petio-les. The FvUFGT94 gene was expressed in various tissues;FvUFGT67 and FvUFGT68 genes had higher expression in roots;FvUFGT95 and FvUFGT96 genes had expression in fruits， which was significantly higher than that of other tissues（P<0.05，the same below）. At the fruits small green stage， turning stage and ripe stage， and the expression levels of the two genes FvUFGT33 and FvUFGT95 in F. vesca red fruit were significantly higher than white fruit during the ripe stage. 【Conclusion】The 7 FvUFGT genes show obvious tissue differences， and FvUFGT33 and FvUFGT95 have high expression in fruit， and the expression in red fruit type is significantly higher than white fruit type. It is speculated that FvUFGT33 and FvUFGT95 play a role in the synthesis of anthocyanins.

Key words： Fragaria vesca; glycosyltransferase gene（UGT） family; gene structure; gene function; expression analysis

0 引言

【研究意义】草莓是蔷薇科多年生草本植物，果实颜色美丽，其色泽由花色苷的种类和含量所决定。类黄酮糖基转移酶（UDP-flavonoid glycosyltrans-ferase，UFGT）作为花色苷合成的关键酶（Boss et al.，1996），可催化花色素进行糖基化，形成稳定的花色苷，其在植物的生长发育过程中发挥重要作用。因此，研究草莓糖基转移酶（UDP-glucuronosyl transferas，UGT）家族进化关系及相关基因表达变化，对探索草莓UGT调控草莓果实发育及花色苷合成等具有重要意义。【前人研究进展】植物UGT属于GT1家族，C末端具有44个氨基酸的保守序列，称为植物二级产物糖基转移酶盒（PSPG盒），其负责糖基的结合（Caputi et al.，2012）。类黄酮、酚酸、萜类及植物激素等小分子化合物是植物UGT主要的糖基受体，UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖等是糖基供体（Lim et al.，2004;Bowles et al.，2006）。迄今为止，已发现UGT作为多基因家族存在于植物中，并在许多植物物种中被研究（Li et al.，2001;Huang et al.，2015），在拟南芥中已鉴定出100多个UGT成员，在其他植物矮牵牛、葡萄和桃等物种中也得到鉴定（Miller et al.，1999;Jones et al.，2003;Ono et al.，2010;Cheng et al.，2014）。UFGT屬于UGT家族，能催化糖基转移反应，催化很多代谢过程，作为花色苷合成过程中最后一个关键酶（Boss et al.，1996），可催化花色素进行糖基化，形成稳定的花色苷，而花色苷的积累对植物细胞具有重要调控作用（Ayenew et al.，2015;Enoki et al.，2017）。研究表明，在葡萄颜色形成过程中，UFGT基因在红色葡萄品种均能表达，但在白色品种中均不表达（Kobayashi et al.，2001;王军和于淼，2010;Sun et al.，2016）;AcUFGT3a能使猕猴桃和苹果的果实呈现红色（Montefiori et al.，2011;Liu et al.，2017）;拟南芥UGT79B2和UGT79B3通过调控花色苷的合成而增强植物对低温、盐及干旱等非生物胁迫的抗性（Li et al.，2017）;还有研究发现FaGT1不仅参与花色苷的合成过程，还影响植物果实的成熟发育（Griesser et al.，2008a），在草莓中，FaGT6可催化槲皮素形成3-O-葡萄糖苷，而FaGT7能催化黄酮醇生成单糖苷（Griesser et al.，2008b）。【本研究切入点】目前，有关UGT家族基因在草莓果实发育成熟及花色苷合成中的作用鲜见研究报道。【拟解决的关键问题】对森林草莓（Fragaria vesca L.）UGT基因（FvUGT）家族的基因结构、保守基序、系统进化及其表达特性等进行分析，为深入研究FvUGT基因功能、探索UGT调控草莓果实发育及花色苷等品质形成提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料为森林草莓的红果（红皮红肉，以下简称森林红果）和白果（白皮白肉，以下简称森林白果）2种类型，种植于郑州果树研究所草莓基地，在2020年3—5月取样。于生长盛期分别采集根、叶柄和叶;并在3个时期采集果实，即小绿期（开花后5～7 d）、转色期（花后23～25 d）及成熟期（花后29～31 d）（图1）。采3个生物重复样品，在液氮中冷冻，并置于-80 ℃冰箱保存备用。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 FvUGT基因家族基因获取及其在染色体上的分布 将FvUGT基因家族基因输入Phytozome数据库（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）进行BLAST分析得到FvUGT基因家族的隐马氏模型序列谱（PF00201），随后，分析得到FvUGT基因家族的基因组序列、CDS序列和蛋白序列。通过ExPASy预测每种UGT蛋白的长度、分子量和理论等电点（pI）。在Phytozome数据库中检索获取UGT染色体的信息（位置和长度），通过MapChart分析FvUGT基因家族基因在染色体上的分布情况

1. 2. 2 FvUGT基因家族的基因结构、基序、蛋白系统发育分析和KEGG信号通路富集 根据FvUGT基因家族的CDS序列及其基因组DNA序列，利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在线分析FvUGT基因家族基因的结构。采用MEME（http：//meme.sdsc.edu/meme/meme-in.tro.html）分析FvUGT基因家族基因的基序模式，将基序数设置为8，分析FvUGT基因家族基因的保守基序。使用ClustalW程序通过邻接法（Neighbor-joining，NJ）对草莓与拟南芥的UGT氨基酸序列进行比对，构建系统发育进化树。将FvUGT基因家族基因的序列提交至KEGG数据库，通过在线分析UGT基因家族主要参与的代谢途径。

1. 2. 3 FvUFGT基因家族基因表达分析 取森林草莓的根、叶柄、叶和果实3个时期的样品，在液氮中研磨，使用E.Z.N.A Plant RNA Kit（Omega USA）试剂盒提取森林草莓各样品总RNA;参照TaRaKa反转录试剂，将总RNA反转录合成cDNA，并将cDNA稀释到200 ng备用。利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR扩增引物（表1），以FvActin为内参基因，检测各样品中FvUGT基因家族基因的表达情况。反应体系：15.0 μL： SYBR Green I Master Mix7.5 μL，正、反向引物各0.5 ?L，cDNA模板2.0 ?L，ddH2O 4.5 ?L。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 10 s，58 ℃20 s，进行43个循环;72 ℃延伸20 s。每个样品进行3次重复。目的基因相对表达量采用2-ΔΔCt进行换算（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2010进行整理，并利用SPSS 17.0分析数据间的差异显著性。

2 结果与分析

2. 1 FvUGT基因家族成员获取及蛋白理化性质分析

在Phytozome数据库共检索获得138个UGT基因家族成员，分别命名FvUGT1～FvUGT138。FvUGT基因编码蛋白的理化性质预测结果表明，FvUGT基因家族氨基酸序列长度为171～1751 aa，蛋白分子量为19.64～193.74 kD，FvUGT基因的理论等电点的范围为4.43～9.54，其中126个蛋白理论等电点小于7.00，偏酸性，其余12个蛋白的大于7.00，偏碱性。FvUFGT蛋白不稳定系数介于29.43～61.27，脂肪族氨基酸指数在75.52～102.63，GRAVY值在-0.486～0.123，有121个蛋白的疏水性小于0，而FvUGT16、FvUFGT33、FvUGT35和FvUFGT56等17个蛋白的疏水性大于0，表明这些蛋白是亲水性蛋白。

2. 2 FvUGT基因家族基因在染色体上的分布情况

为了解FvUGT基因家族基因组分布，从植物基因组数据库中检索得到基因组注释信息，分析FvUGT基因的染色体位置（图2）。结果发现138个FvUGT基因在6个染色体上分布不均，其中FvUGT76、FvUGT77、FvUGT78、FvUGT79、FvUGT80和FvUGT-81等11个基因无法定位在具体的染色体上;6号染色体包含最多的FvUGT基因（37个成员），其次是位于3号染色体上的34个成员，分布基因最少的是1号染色体，仅6个基因，4号、5号和7号染色体上的FvUGT基因分布较零散（图2）。

2. 3 FvUGT基因家族成员的基因结构和保守基序分析

利用GSDS对138个FvUGT基因的结构进行分析，发现外显子的数量分布不均匀，包括1～29个（图3）。外显子数目最多的是FvUGT4基因，其基因的结构也最复杂，外显子数目29个，内含子数目28个;有54个FvUGT基因的结构比较简单，只有1个外显子。进化树上聚在一起，表明亲缘关系越近，FvUGT基因的结构越相似，但FvUGT基因外显子位置和数目、内含子长度在不同FvUGT基因家族成员间均存在差异，说明FvUGT基因家族成员的结构已发生一定分化。

为了解FvUGT基因家族基因的保守基序，通过MEME对FvUGT蛋白进行保守基序搜索，共获得8个保守区域（图4）。分析还发现，聚类在同一分支的FvUGT蛋白具有相似的基序组成，不同进化分支的基序组成存在差异，而保守基序的差异会引起基因功能的改变。聚类在同一分支的FvUGT蛋白，其基序相同，提示聚类在同一分支的不同蛋白功能可能相同。

2. 4 FvUGT基因家族成员系统发育进化分析

为揭示FvUGT基因家族成员的同源进化关系，以拟南芥基因家族为参考，将草莓和拟南芥的UGT蛋白序列构建系统发育进化树（图5）。结果发现FvUGT基因家族可分为12个类群（A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N），每个类群分别包含16、2、23、32、8、1、5、5、57、3、21和4个成员（表2），每个类群均参照拟南芥亚群进行分类，其中B、D、E、F和L组的成员与类黄酮生物合成相关。根据FvUGT基因的注释信息，推测D组的FvUGT5、FvUGT87、FvUGT90、FvUGT92、FvUGT93、FvUGT94、FvUGT95和FvUGT-96，E组的FvUGT67、FvUGT68、FvUGT70和FvUGT-74，以及F组的FvUGT33均属于UFGT基因，并按原有编号（n）命名为FvUFGTn。

2. 5 KEGG信号通路富集分析

将138个FvUGT蛋白序列提交KEGG数据库，结果发现，FvUGT蛋白参与次生代谢产物的生物合成、苯丙烷生物合成、玉米素的生物合成和代谢等途径（表3）。其中，有6个FvUGT蛋白参与玉米素的生物合成，10个FvUGT蛋白参与苯丙烷生物合成，19个FvUGT蛋白参与次生代谢产物的生物合成，1个FvUGT蛋白参与类黄酮生物合成等。

2. 6 森林草莓FvUFGT基因表达分析

通过系统发育进化树分析，从参与类黄酮相关的D、E和F亚族挑选7个FvUFGT基因，实时荧光定量PCR检测结果（图6）表明，7个FvUFGT基因表現出明显的组织差异性，其中FvUFGT70基因在森林白果和森林红果的叶和叶柄中均有表达，且在白果中的表达量显著高于红果（P<0.05，下同）;FvUFGT94基因在各组织中均有表达，但在森林红果和森林白果的果实中差异不显著（P>0.05）。FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有较高表达;FvUFGT33基因在森林红果的果实中有较高表达，在森林白果的果实中有极低表达;FvUFGT95和FvUFGT96基因在果实中有表达，显著高于其他组织。本研究通过实时荧光定量PCR分析森林草莓果实小绿期、转色期和成熟期的表达变化，结果（图7）显示，随着果实的生长，FvUFGT基因的表达模式不同。其中，FvUFGT33基因在森林红果中随着果实生长，其表达量越来越高，在成熟期达最高值，而其在森林白果整个果实发育阶段表达量相对极低或不表达;FvUFGT95基因在草莓红果中的相对表达量一直呈上升趋势，而在森林白果中的相对表达量呈先上升后下降;在成熟期，FvUFGT33和FvUFGT95基因在森林红果中的相对表达量显著高于森林白果。

3 讨论

本研究通过Phytozome数据库在森林草莓中获得138个FvUGT基因，发现FvUGT基因家族成员总数较黄瓜（85）和拟南芥（107）多（Li et al.，2001），但比茶（132）、梨（139）、玉米（147）、桃（168）、毛杨果（178）、小麦（179）、水稻（180）、葡萄（181）和苹果（241）等作物中的UGT成员少（Caputi et al.，2012;Li et al.，2014;Cui et al.，2016;Wu et al.，2017;He et al.，2018）。在不同物种中，UGT家族成员的数量不同，可能与每个物种基因组中预测的基因总数和基因组总大小有关（Caputi et al.，2012）。本研究发现，FvUGT基因家族基因在除2号染色体外的其他6条染色体上均有分布，且在染色体上分散分布。在拟南芥和棉花中也发现类似的UGT基因家族基因分布模式（Li et al.，2001;Huang et al.，2015）。内含子虽然对蛋白氨基酸序列无贡献，但其位置和数量会影响蛋白多样性和整体细胞功能。通过内含子的相对位置可预测某些线索，包括基因及其编码蛋白进化关系，并进一步促进基因家族的多样化（Rogozin et al.，2000;Li et al.，2014）。本研究中，138个FvUGT基因的内含子数量不同（1～28），其中内含子数目最多的是FvUGT4基因，为28个，其基因的结构也最复杂。在138个已鉴定的FvUGT基因中，有39%缺乏内含子，与于拟南芥、亚麻和玉米的报道一致，其分别有58%、55%和60%缺乏内含子（Li et al.，2001;Barvkar et al.，2012）。

利用實时荧光定量PCR对7个FvUFGT基因在森林草莓各组织中的表达情况进行检测，发现FvUFGT基因在不同组织中有不同的表达，表明不同基因在不同部位发挥作用。FvUFGT94基因在森林红果和森林白果2种不同类型的果实中的表达量无显著差异，在各组织中有较高表达，可能参与草莓的整个生长发育过程;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有较高表达，推测该基因会影响森林草莓根的生长发育;FvUFGT95和FvUFGT96基因在果实中有较高表达水平，推测其影响森林草莓果实生长。FvUFGT基因不仅在森林草莓果实中表达，在其他组织也均有表达，且表达量较高，推测FvUFGT基因除了在果实中参与花色苷合成，还可能在其他组织中参与类黄酮糖基化。在其他类似研究中，日本牵牛花UFGT基因不仅参与花色苷的合成，对花色素的糖基化和酰基化也起作用（Morita et al.，2015）;矮牵牛中的UFT79B31基因可调控花粉的类黄酮糖基化（Knoch et al.，2018）;草莓中UGT71K3也会影响葡萄糖酰基间苯三酚的含量（Song et al.，2016）。本研究通过对FvUFGT基因在果实不同发育期的表达分析，发现FvUFGT33和FvUFGT95基因在森林草莓红果成熟期表达水平极高，而在森林草莓白果成熟期表达量低，推测这2个基因在花色苷合成中发挥作用。这与许多研究结果类似，如在红色和白色葡萄相关研究中发现，UFGT基因在红色品种中表达，而在白色品种中不表达（Kobayashi et al.，2001;王军和于淼，2010;Sun et al.，2016）;刺葡萄转录组分析发现，UFGT基因在黑果刺葡萄中有较高表达，而在白果刺葡萄中不表达。

4 结论

7个FvUFGT基因表现出明显的组织差异性，其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果实中有较高表达量，且在森林草莓红果类型表达量显著高于白果类型，故推测其在花色苷合成中发挥作用。

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（責任编辑 邓慧灵）