黄连油化学成分分析、安全性和体外抗炎活性研究

韩进华　李生慧　于钰

黄连油来源于临床上广泛用于治疗皮肤生理损伤病的经典中药方剂黄连膏，通过GC-MS方法分析鉴定了黄连油的主要活性成分，HET-CAM、人体皮肤重复性开放型涂抹试验分析黄连油刺激性和安全性，体外细胞实验进行其抗炎活性的研究。研究结果显示，黄连油中含有多种不饱和脂肪酸和多种活性成分。HET-CAM结果显示刺激评分小于1，预示黄连油无眼刺激或轻度刺激，人体皮肤重复性开放型涂抹试验结果显示黄连油刺激性较小，安全性较高，适合问题肌肤人群使用。黄连油通过抑制因子TNF-α、IL1-α、IL-6和IL-8分泌活释放来发挥抗炎作用。结果表明，黄连油含有多种有效成分，性质温和，刺激性低，对皮肤具有良好的抗炎作用，在皮肤护理品中具有良好的应用前景。

近年来，越来越多的人受到皮肤问题的困扰，如湿疹、过敏等，针对问题肌肤人群开发一款温和有效的护肤品迫在眉睫。黄连油来源于临床上广泛用于治疗皮肤生理损伤病的经典中药方剂黄连膏，以芝麻油为溶剂，提取黄连、姜黄、黄柏、生地黄、当归中的有效成分。方剂中，黄连清热利湿，姜黄破血行气，黄柏清火解毒，生地清热生津，凉血滋阴润燥，当归活血养血。在医院皮肤科、烧伤科、普外科等科室应用中具有可靠的临床效果，其对皮肤湿疹，烧烫伤、痔疮、新生儿红屁股、褥疮、粉刺等有理想的治疗效果。

炎症是大多数皮肤生理损伤疾病的正常生理反应，可由微生物感染和组织损伤引发。它的特点是大量促炎介质释放，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素、IL-1、IL-6和IL-8，它们被认为是开发抗炎药的重要目标。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成部分，不仅能诱导促炎细胞因子的释放，还能促进炎症介质的产生，被认为是导致炎症的因素之一。巨噬细胞作为免疫细胞具有多种功能，不仅可以清除细胞碎片和病原微生物，还可以分泌细胞因子和其他介质。小鼠RAW264.7细胞具有稳定性好、可持续传代培养等优点。因此，LPS诱导的RAW264.7细胞常被用作体外实验中的体外炎症细胞模型。

本研究主要分析了黄连油的化学成分，评估了黄连油的刺激性和安全性。此外，选择“LPS-巨噬细胞”作为炎症模型来评估黄连油的抗炎作用，为其作为问题肌肤护理产品的开发使用提供科学依据。

01.材料与方法

1.1材料

3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）购自Biodee bio生物有限公司（中国北京）;脂多糖（LPS）购自Sigma（USA）;胎牛血清（FBS）购自Biological Industries（ISRAEL）;DMEM（H）、二甲亚砜（DMSO）购自索莱宝生物科技有限公司（中国北京）;小鼠IL-6 ELISA试剂盒、小鼠IL-1αELISA试剂盒、小鼠IL-8 ELISA试剂盒、小鼠TNF-αELISA试剂盒、组织上清液NO试剂均购自南京建成生物工程研究所（中国南京）;鸡胚胎为购自新兴大华农家禽蛋有限公司（中国广州）。研究中所用其他溶剂和化学品均为分析纯。

1.2方法

1.2.1黄连油的制备

取适量黄连、姜黄、生地、黄柏、当归尾并进行粉碎后，加入适量芝麻籽油，于150℃下将药材炸枯，冷却至室温并过滤，弃药渣，即得黄连油。

1.2.2黄连油成分分析

通过气相色谱质谱仪（Thermo Scientific，TRACE 1310）、热解气相色谱质谱仪（Thermo Scientific，TRACE 1310;Frontier，EGA/PY-3030D）和顶空气相色谱质谱仪（Thermo Scientific，TriPlus 500、TRACE 1310））对黄连油进行成分分析，通过计算机完成总离子流图谱分析，同时通过NIST11S检索定性比对，并利用谱图计算峰面积，从而进一步得到黄连油成分的相对分子质量。

1.2.3黄连油安全试验

1.2.3.1鸡胚绒毛尿囊膜试验

取9日龄鸡胚（SPF级，白来杭鸡）进行蛋检，在蛋壳表面标记气室位置;用牙科锯齿弯钳剥离标记的蛋壳部分，露出白色的蛋膜，加入适量生理盐水润湿蛋壳膜，然后用弯性牙科小镊子小心地剥离蛋壳膜，露出尿囊膜。肉眼观察尿囊膜的完整性及有无出血点的变化。如果有出血点或尿囊膜（CAM）破损则剔除，不能用于进一步的测试。应注意小心操作不要破坏蛋膜的完整性。

取0.3mL黃连油原液，直接滴在CAM表面，观察CAM反应，并在作用后5min内记录每种毒性作用出现的时间。每个样品做6个有效鸡胚。阳性对照为1%SDS;阴性对照为生理盐水。

结果计算与评估：

在公式：

sec H…CAM膜上开始观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒（s）;

sec L…CAM膜上开始开始发生血管溶解的平均时间，单位为秒（s）;

sec C…CAM膜上开始观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒（s）

根据计算的IS数值按表1对受试物眼刺激性进行分类。

1.2.3.2皮肤重复开放式斑帖试验

参照我国2015年版《化妆品安全技术规范》中《人体皮肤斑贴试验》的方法。选取符合要求的30名志愿者，选取受试者前臂弯曲侧3×3cm²区域涂黄连油0.05 mL，每天2次，连续了天，观察皮肤反应。150g*L-1SDS溶液为阳性对照，生理盐水为空白对照。人体重复开放式涂片试验，判断标准见表2。

1.2.4黄连油的抗炎作用

1.2.4.1细胞培养和细胞活力测定

小鼠巨噬RAW264.7细胞系购自中国科学院细胞资源中心（中国上海），在5%CO₂的加湿培养箱中培养，37℃，DMEM（H）添加10%FBS和1%链霉素/青霉素。将细胞以5×10³个细胞/孔接种在96孔板中。24h后，吸出上清液后，加入100μL/孔的MTT溶液（终浓度，1mg*mL-1），37±1℃培养4 h。然后吸出上清液，用150μL DMSO溶解甲躜晶体。使用Azure Biosystem酶标仪（Azure AO，USA）在570nm处测定每个孔的光密度。

细胞存活率计算公式：

细胞存活率=（测定组吸光度-空白对照组吸光度）/（细胞对照组吸光度-空白对照组吸光度）×100%。

1.2.4.2“LPS-巨噬细胞”炎症模型的建立和细胞因子的测定

将细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔培养板上。接种24h后，不同浓度LPS（100μg*mL-1、75μg*mL-1、50μg*mL-1、25μg*mL-1、10μg*mL-1、5μg*mL-1、2.5μg*mL-1、1μg*mL-1）刺激24h。结合细胞活力和炎症因子（NO）水平确定LPS的最佳刺激反应条件，建立炎症模型进行后续试验。

按照产品说明书使用ELISA试剂盒测量细胞上清液中INF-α、Ib-1α、IL-6和IL-8的水平。按照产品说明书测量细胞培养物上清液中的NO水平。

细胞因子抑制率=（模型组-试验组）/模型组*100%

1.2.4.3药物处理

将细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔培养板上。接种24h后，不同浓度的黄连油（使用DMSO增溶使其终浓度为：50 μL*mL-1、10μL*mL-1、5μL*mL-1 1μL*mL-1、0.5μL*mL-1、0.1μL*mL-1、0.05μL*mL-1）在37±1℃下培养细胞24h后，MTT法测定细胞活力。根据细胞存活率选择合适浓度进行后续炎症因子的测定试验。

将细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔培养板上24h后，合有LPS（终浓度5pg*mL-1）和不同浓度黄连油中37±1℃下培养细胞24h后，取上清液，进行细胞因子的测定。

02.结果

2.1黄连油化学成分分析

黄连油的化学成分分析采用气相色谱质谱仪、热解气相色谱质谱仪和顶空气相色谱质谱仪。使用质谱数据系统获得相关峰的保留时间数据。黄连油的定性和定量化学成分分析结果见表3。

2.2黄连油安全试验

2.2.1鸡胚绒毛尿囊膜试验

鸡胚绒毛膜尿囊膜试验结果显示（见表4），黄连油组6只鸡胚5min后无出血、凝固或血管溶解。刺激评分小于1，预示黄连油对眼睛无刺激或刺激很小。

2.2.2皮肤重复开放涂片试验

对30名受试者的前臂受试部位观察了天，结果显示（表5）无红斑、皮肤干燥、皱纹、红斑、水肿、丘疹、脱屑等现象，说明该配方黄连油刺激性小，安全性较高，适合问题性肌肤人群的使用。

2.3黄连油的抗炎作用

2.3.1“LPS-巨噬细胞”炎症模型的建立

用不同浓度的LPS刺激巨噬细胞24h后，检测巨噬细胞的存活率和上清液中NO的含量。当LPS浓度为5μg*mL-1时，细胞存活率最大，上清液中NO含量最大（见图-1）。因此，以浓度为5μg*mL-1LPS刺激RAW264.7细胞建立“LPS-巨噬细胞”炎症模型用于以下实验。

2.3.2黄连油对巨噬细胞的毒性试验

巨噬细胞在合不同黄连油的培养基中培养24h后，MTT法检测细胞活力。结果如图-2所示。黄连油浓度为（0.05-20）pL*mL-1，细胞存活率大于80%;当浓度为1μL*mL-1时，巨噬细胞的存活率最大。选择浓度为1μL*mL-1、5μL*mL-1、10μL*mL-1的黄连油，用于后续细胞因子测定。

2.3.3细胞因子抑制率

巨噬细胞在含有LPS（终浓度5pg*mL-1）和黄连油（终浓度1、5、10μL*mL-1）的培养基中培养24h后，取上清液测定因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8水平并计算抑制率。结果（图-3）表明黄连油对TNF-α、IL1-α、IL-6和IL-8的水平有较强的抑制作用，10μL*mL-1的黄连油对TNF-α、IL-6、IL-8有明显的抑制作用;1μL*mL-1黄连油对IL-1α有明显抑制作用。

03.讨论

细胞因子是细胞释放的生物活性物质的小分子，可以通过多种方式参与调节免疫反应和炎症反应。LPS是炎症过程中最早和最重要的炎症介质，可以诱导和刺激巨噬细胞分泌TNF-G、IL-1、IL-6和IL-8等炎性细胞因子，可激活中性粒细胞和淋巴细胞，增加血管内皮细胞的通透性，调节其他组织的代谢活性，促进其他细胞因子的合成和释放。IL-1是诱发炎症反应的重要介质之一，它能激活多种免疫细胞和炎症细胞，并与TNF-α协同作用，诱发炎症和机体防御反应。IL-6来源于TNF-α和IL-1β诱导的细胞和组织，参与体内信号分子的传递引起炎症I，诱导B细胞分化产生抗体，并诱导T细胞激活增殖分化，参与机体免疫反应，是炎症反应的触发器。L-8可刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化性，促进中性粒细胞脱粒，释放弹性蛋白酶，损伤内皮细胞，引起微循环血流瘀滞，组织坏死，造成脏腑功能障碍，其含量可以反映體内炎症和组织损伤的程度。

在本研究中，黄连油以芝麻籽油为溶剂，提取黄连、姜黄、黄柏、生地、当归尾。结果显示，黄连油含有多种活性成分，脂肪酸包括亚油酸（37.58%）、油酸（24.6%）、棕榈酸（5.35%）等;活性成分包括姜黄素（9.10ug）/mL）、阿魏酸（12.20ug/mL）、盐酸小檗碱等。黄连油对TNF-α、IL1-α、IL-6和IL-8的水平有很强的抑制作用。黄连常用于治疗炎症性疾病的中药方剂。据报道，黄连的抗炎作用与五种生物碱（小檗碱、黄连素、表小檗碱、巴马汀和药根碱）的含量呈正相关。黄连素抑制核因子KBα抑制剂（lKBa）的降解和细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun NH2末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸肌醇3-激酶/Akt（PI3K/Akt）的磷酸化。黄连素还可以抑制角叉菜胶引起的大鼠爪水肿，并减少大鼠炎症组织中TNF-α和NO的释放。姜黄素已显示出多种药理活性，包括抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌和心血管保护作用。姜黄素通过抑制核因子kappa-B（NF-KB）、toll样受体4（TLR4）和丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPKs）等不同信号通路，并抑制环氧合酶-2（COX-2）、一氧化氮（NO）和促炎细胞因子（白介素（1L）-1β、IL-6、IL-18和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））。研究表明，LA、ALA和DHA三种多不饱和脂肪酸，减少了LPS刺激的IL-6、IL-1β和TNFβα的产生，并呈剂量依赖性。

综上所述，黄连油含有多种有效成分，脂肪酸包括亚油酸（37.58%）、油酸（24.6%）、棕榈酸（5.35%）等;活性成分包括姜黄素（9.10 μg*mL-1）;阿魏酸（12.20μg*mL-1）、盐酸小檗碱等。此外，依据鸡胚绒毛膜尿囊膜试验结果可预示黄连油无眼刺激性或轻度刺激性。皮肤重复开放式斑帖试验表明，黄连油刺激性低，安全性高，适合敏感肌肤使用。最后，黄连油对TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-8有较高水平的抑制作用，表明其对敏感皮肤的护理方面具有一定的运用潜力。