大蒜多糖用于化妆品的安全性评价及功效研究

杨小玉　谭淇丹　骆霜霜　高伟　刘蕾

大蒜用于医药与卫生历史悠久，大蒜多糖是大蒜鳞茎提取物的主要成分之一，具有抗氧化、抗炎、抑菌等多种活性，有很高的开发价值。论文中对大蒜多糖的理化性质、刺激性、安全性进行测试，对其保湿性进行人体短期保湿功效评价，对其抗氧化性进行体外生化水平功效评价。结果表明，该提取工艺下的大蒜多糖不具有眼刺激性，安全性良好，并且具有良好的保湿性能与抗氧化活性，为大蒜多糖的提取及在化妆品中的开发利用提供了新的思路和一定的科学支撑。

大蒜（英文名称Garlic;拉丁名称Allium sativum L.），为百合科（Liliaceae）葱属（Allium）植物的地下鳞茎，也可称为独蒜、胡蒜。其由于独特的风味和保健功效，数千年来，以无致敏性、无副作用、无毒性的独特优势被广泛用作常见的食用香料和药物l 2l。现代医学已证实大蒜具有多种药理作用，如降血脂、保护肝功能、抗糖尿病，抗疲劳等。此前的化学成分调查表明，大蒜除合硫挥发物（大蒜素）外，还含有多糖、黄酮类化合物、简单酚类化合物等，其中大蒜多糖是大蒜中含量较高的活性成分之一，可达干重的80%。大蒜的药用保健作用也与大蒜多糖有很大关系。

大蒜鳞茎中含有丰富的蛋白质、低聚糖和多糖类，还有脂肪、矿物质等。大蒜多糖主要是从鳞茎中分离出来的，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等了种单糖组成，具有很高的开发价值。近年来，临床研究表明，大蒜多糖是大蒜的主要功效成分，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗血凝、抗尿糖、抗肿瘤、抗衰老等生物活性，具有很高的研发价值。

对于大蒜多糖的结构和理化性质，目前国内外的研究较少。由于材料不同、提取方法不同，得到的大蒜多糖理化性质也有较大的差异。研究中对由晨光生物科技集团股份有限公司提供的大蒜多糖理化性质进行检测，依据《已使用化妆品原料目录（2021版）》中关于蒜（ALLIUM SATIVUM）鳞茎提取物的驻留类产品最高历史使用量确定了本研究中大蒜多糖的添加量为1%，通过红细胞溶血实验与人體斑贴实验对其进行刺激性与安全性评价，并综合评价了大蒜多糖的体外保湿性和抗氧化性，为大蒜多糖在化妆品领域的开发应用提供一定理论依据与技术支撑。

材料与方法

1.1材料与试剂

多糖含量为90%以上的大蒜多糖（由晨光生物科技集团股份有限公司提供），磷酸盐缓冲液（PBS），十二烷基硫酸钠（SDS），新鲜兔血（北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），无水乙醇，抗坏血酸（维生素C），三羟甲基氨基甲烷（Tris），盐酸，邻苯三酚（焦性没食子酸），基础面霜原料（PEG-100硬脂酸甘油硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇、甘油硬脂酸酯、液体石蜡、肉豆蔻酸异丙酯、聚二甲基硅氧烷、甘油、丁二醇、黄原胶、EDTA二钠、苯氧乙醇-乙基己基甘油、去离子水）。

1.2主要仪器

pH计（型号FE28，梅特勒一托利多仪器有限公司）、电导率仪（型号DDS-30TA，上海精密科学仪器有限公司）、台式冷冻离心机（型号Centrifuge 5810 R，Eppendorf）、酶标仪（型号Infinite M200 PRO，TECAN）、摇床（型号KYC-100C，上海福玛实验设备有限公司）、斑试器（北京百亿怡达科技开发有限公司）、皮肤水合测试仪（型号Corneometer CM 825，德国CK）、皮肤水散测试仪（型号Tewameter TM 300，德国CK）、分析天平（型号ME204/02，梅特勒-托利多仪器）、水浴锅（型号HHS，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.3试验方法

1.3.1理化性质检测

利用pH计检测大蒜多糖提取物（浓度为10mg/mL）的pH值。利用电导率仪检测大蒜多糖提取物（浓度为10mg/mL）的电导率值。

1.3.2红细胞溶血试验

根据田妮娜等人的方法采用红细胞溶血实验对大蒜多糖的眼刺激性进行了测试评价，并稍作修改。大蒜多糖配置六个梯度浓度溶液：20mg/mL、15mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL。各浓度梯度样品溶液与RBC悬液按975μL样品+25μLRBC混匀。将不同浓度大蒜多糖溶液一RBC混合液在室温下180r/min孵育1h。将各EP管置于离心机中，10000r/min速度离心min，终止孵育。用酶标仪测量其在540nm处的OD值。每个浓度在96孔板中点三个平行，结果取平均值。

阴性对照（零溶血）：975μL PBS+25μL RBC，设阴性对照的溶血率为0%。

阳性对照（完全溶血）：975μL超纯水+25μL RBC，设阳性对照的溶血率为100%。

1.3.3人体皮肤斑贴试验

1.3.3.1制备1%大蒜多糖的面霜

1%大蒜多糖面霜的配方表见表1。

按照重量分数分别称取A相（油相）、B相（水相）物质放入不同烧杯。

用玻璃棒搅拌加热A相原料，升温至80～85℃。

用玻璃棒搅拌加热B相原料，升温至80～85℃后持续搅拌iOmin，转速为50r/min。

将A相料液加入B相烧杯中进行均质，均质转速为5000r/min，均质8min。

以转速40r/min搅拌降温至45℃，加入待测功效原料，同时加入C相和少许香精，搅拌降温。

搅拌均匀至室温后称量，装入已经灭菌的样品瓶、标记。

1.3.3.2人体皮肤斑贴试验

参照GB/T 17149.1-1997《化妆品皮肤病诊断标准及处理原则总则》与GB/T 17149.2-1997《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》，对大蒜多糖的安全性进行评价。

随机选取30名18～60岁前臂无皮损健康志愿者进行为期24h的斑贴试验。

选用面积不超过50mm²、深度约1mm的合格斑试器材。将受试物放入斑试器小室内，用量为0.020～0.025g。对照孔为两组，分别为：①基础面霜对照组;②空白斑试器组。将斑试器贴敷于受试者的前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。

分别于去除受试物斑试器后30min（待压痕消失后）、24h和48h按表2标准观察皮肤反应，并记录观察结果。

1.3.4人体短期保温功效评价

1.3.4.1制备1%大蒜多糖的面霜及基础面霜

设置两组样品组：①大蒜多糖组：1%大蒜多糖面霜。②基础面霜组：以未添加功效成分的基础面霜。

1%大蒜多糖面霜的配方表与制备流程与1.3.4.1相同。基础面霜未添加1%大蒜多糖，其他原料及操作步骤与1%大蒜多糖面霜一致。

1.3.4.2人体短期保湿功效评价

根据2012年7月1日实施的我国首个化妆品保湿功效评价行业标准——《化妆品保湿功效评价指南》（QB/T4256—2011），使用电容法测人体皮肤角质层含水量（MMV）与经皮失水（TWEL）值。

本实验根据《化妆品保湿功效评价指南》要求招募志愿者共32名。

测试环境温度为21℃±1℃;测试环境湿度为50%±5%，并进行实时的动态监测。

测试前，志愿者清洁双手前臂内侧，并用面巾纸轻轻擦干，室内静坐20min，前臂呈测试状态暴露放置，保持放松状态。分别在志愿者双手前臂内侧同一位置共绘制2个3cm×3cm测量区域，并标记。首先测量未涂抹样品时各个测量区域的本底皮肤水分含量（M MV）和经皮失水（TWEL）值，每个区域进行5次平行测量，取平均值。然后按（2.0 mg±0.1mg）/cm²的样品用量，使用乳胶指套将大蒜多糖组和基础面霜组分别均匀涂布于不同测量区域内。涂抹后分别在lh、2h和4h测量皮肤水分含量（MMV）和经皮失水（TWEL）值。

计算不同时间段的MMV均值和TEWL均值，与未涂抹样品时的数據进行比较，计算其变化百分数，即水合=（样品-空白）/空白，水散=（空白-样品）/空白。

1.3.5抗氧化功效性试验

1.3.5.1 DPPH自由基清除试验

用乙醇配置2×10^-4mol/L DPPH溶液。

用30%无水乙醇溶液配制待测样品（8%大蒜多糖），再用30%无水乙醇溶液进行对半稀释（2、4、8、16、32倍）。

样品浓度见表3。

阳性对照：用0.01%的维生素C溶液。

空白对照：无水乙醇。

反应体系见表4。

避光反应30 min后，在517 nm下测A₁、A₂、A₃管吸光度值。

清除率公式：清除率（%）=[（A₂+A₃）-A₁]/A₂×100%

1.3.5.2超氧阴离子自由基清除实验

配制实验试剂：pH为8.4的Tris-HCl溶液、邻苯三酚溶液、3 mol/L的盐酸溶液。

样品浓度见表5。

阳性对照：0.1%维生素C溶液。反应体系见表6（其中邻苯三酚溶液迅速加入）。

清除率公式：清除率（%）=（A-B+C）/A×100%

1.4数据统计分析

每个样品3次重复实验，实验结果表示为平均值，数据处理采用WPS Office 2018，绘图采用Origin 95-64。

结果与分析

2.1理化性质检测

大蒜多糖的理化指标检测结果见表7。

2.2红细胞溶血试验

如图1所示，大蒜多糖在低浓度至高浓度下均未显示出有明显的溶血现象。表明一定浓度范围内大蒜多糖不具有眼刺激性。

2.3人体皮肤斑贴试验

去除斑试器0.5h后，试验结果见表8。

去除斑试器24h后，试验结果见表9。

大蒜多糖经人体皮肤斑贴试验检测结果：阴性反应。实验结果显示，添加1%的大蒜多糖面霜安全性良好。

2.4人体短期保湿功效评价

如图2所示，含1%大蒜多糖面霜，在涂抹完样品1h、2h时，其保湿能力与基础面霜相比差异不显著。在涂抹4h时，保湿能力优于涂抹4h时的基础面霜，并具有显著差异性（p<0.05）。表明添加1%大蒜多糖的面霜保湿性能良好，并且随着时间的增长保湿能力有所提高。

如图3所示，添加1%大蒜多糖的面霜与基础面霜相比，4h经表皮失水值较空白组下降的程度比基础面霜更大，说明添加了1%大蒜多糖的面霜在一定程度上具有持久锁水能力。

2.5抗氧化功效性试验

2.5.1 DPPH自由基清除试验

图4所示为不同浓度大蒜多糖对DPPH自由基清除能力，可以看出，大蒜多糖在浓度为40%以下时，其自由基清除率高于阳性对照组维生素C。当大蒜多糖浓度为10%～40%时，大蒜多糖具有很强的DPPH自由基清除能力，推测具有较强的体外抗氧化能力。

2.5.2趁氧阴离子清除实验

如图5所示，大蒜多糖与浓度为0.01%的维生素C相比具有比较好的超氧阴离子清除能力，推测具有较好的体外抗氧化能力。

结论

目前，大蒜多糖的提取工艺、护肤价值等并没有得到充分研究开发。本研究以多糖含量为90%以上的大蒜多糖为原料，检测了该大蒜多糖的理化性质，通过红细胞溶血试验与人体皮肤斑贴试验证实了大蒜多糖具有较好的安全性。在功效性研究方面，人体短期保湿功效评价的结果显示添加1%大蒜多糖的面霜较基础面霜拥有更好的保湿锁水能力，体外生化试验中也证明大蒜多糖具有良好的清除自由基的能力。

大蒜多糖在化妆品、药品等领域均有较大的开发价值，但其作用效果和机制的体外研究是其获得充分利用的基础。本研究系统阐述了大蒜多糖作为化妆品原料的应用潜力，为大蒜多糖的提取开发提供技术支持与理论支持。