紫外分光光度法测定血管瘤乳膏中马来酸噻吗洛尔含量的4种定量分析方法比较

陈晓文，朱浩，吴飞华，原永芳（上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海 200011）

婴幼儿血管瘤是儿童最常见的良性肿瘤，目前公认的一线治疗药物是口服非选择性β受体阻滞剂普萘洛尔，但其存在全身不良反应，包括心动过缓、低血压、支气管痉挛等，且口服普萘洛尔肝脏首过效应强，个体差异大[1]，继而有研究外用普萘洛尔用于面积小、位置表浅的血管瘤患儿[2]。噻吗洛尔与普萘洛尔同属非选择性β受体阻滞剂，其作用强度为普萘洛尔的8 倍，无内源性拟交感活性，无直接抑制心脏作用。2010年有报道局部外用马来酸噻吗洛尔眼药水治疗眼睑血管瘤有效，可以使治疗药物噻吗洛尔富集于病灶部位发挥作用并且明显减少药物对全身的影响，更为安全，尤其适合于面部和眼周区域的浅表型病灶[3-4]。但目前国内尚无商品化的噻吗洛尔凝胶制剂[5]，市售马来酸噻吗洛尔滴眼剂使用不方便，且存在敷药后易蒸发，剂量不容易掌握，长期使用会致皮肤干燥、脱皮等缺陷，不利于临床使用[6]。为此，本院自行研制了血管瘤乳膏，含0.5%马来酸噻吗洛尔，适用于婴幼儿血管瘤。为更好地对该制剂进行质量控制，参考《中国药典》2020年版采用紫外分光光度法作为马来酸噻吗洛尔制剂中噻吗洛尔含量的测定方法[7]，并选取紫外分光光度法中的标准曲线法（298 nm）、吸收系数法（298 nm）、双波长法（测定波长298 nm、参比波长330 nm）、一阶导数法（316 nm）对血管瘤乳膏中马来酸噻吗洛尔的含量定量分析进行了方法学考察。

1 材料

1.1 仪器

紫外分光光度计（日本岛津公司）；电子分析天平（德国Sartorius 公司，d ＝0.1 mg）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2 试药

马来酸噻吗洛尔（天津市中央药业有限公司，批号：180301，纯度：99.9%），血管瘤乳膏（规格：20 g/0.1 g，批号：190410、190430、190507）及不含噻吗洛尔的空白乳膏均为院内自制。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

精密称定经105℃干燥至恒重的马来酸噻吗洛尔，加乙醇振摇溶解后，定量配制成质量浓度为20 μg·mL－1的对照品溶液，即得。

2.2 样品溶液的配制

精密称取血管瘤乳膏1 g，加适量乙醇水浴振摇溶解，置冰箱中冷却30 min。过滤，滤液用乙醇定容至50 mL 量瓶。再精密量取10 mL 至50 mL 量瓶中，加乙醇至刻度，即得。

2.3 乳膏基质溶液的配制

按照血管瘤乳膏处方及工艺配制不含马来酸噻吗洛尔的空白乳膏。精密称取空白乳膏1 g，按“2.2”项下方法处理，即得。

2.4 测定波长的选择

以乙醇为空白，在250～350 nm 波长内对上述3 种溶液进行紫外扫描，结果见图1，可见马来酸噻吗洛尔在298 nm 波长处有最大吸收，而乳膏基质在此处无吸收，不干扰主分的测定。

图1 3 种溶液的吸收光谱图Fig 1 Absorption spectra of 3 dilutions

2.5 稳定性试验

将对照品溶液避光放置于冰箱，分别于0、1、2、3、5、24 h 时测定吸收度，RSD为0.30%（n＝6），说明马来酸噻吗洛尔乙醇溶液在24 h 内稳定。

2.6 方法的选择[8]

精密称定经105℃干燥至恒重的马来酸噻吗洛尔20 mg，置200 mL 量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 和4.0 mL 分别置10 mL 量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。

2.6.1 标准曲线法 以乳膏基质溶液为空白，照分光光度法在298 nm 波长测定吸收度，绘制吸收度-浓度标准曲线，得回归方程：A＝0.0215C＋1.714×10－3，r＝0.9999，线性范围为10～40 μg·mL－1，见表1。

2.6.2 吸收系数法 根据朗伯-比尔定律，由公式A＝ECL 得出马来酸噻吗洛尔的紫外吸收系数E1%1cm，取平均吸收系数215，RSD为0.98%，见表1。

表1 马来酸噻吗洛尔的紫外吸收系数Tab 1 Absorption coefficient of timolol maleate

2.6.3 双波长法[9]由于马来酸噻吗洛尔在298 nm 波长处有最大吸收，乳膏基质溶液在298、330 nm 波长处有相同吸收度，且马来酸噻吗洛尔两波长处的吸光度差值足够大，所以298、330 nm 可作为双波长法的测定波长和参比波长。以乙醇为空白，在298、330 nm 波长处测定吸收度，绘制吸收度差值-浓度标准曲线，得回归方程：A（298～330）＝0.0191C＋3.629×10－3，r＝0.9999，浓度线性范围为10～40 μg·mL－1，见表2。

2.6.4 一阶导数法 对图1进行一阶导数转换，可见在一阶导数图谱中316 nm 波长处，乳膏基质溶液的振幅Z为0，对照品溶液与样品溶液在此波长处振幅最大且相似，此波长处乳膏基质对测定无干扰，见图2。故以316 nm 作为一阶导数测定波长，以此波长处的振幅Z值作为定量依据。以乙醇为空白，以316 nm 为一阶导数测定波长，绘制振幅值-浓度标准曲线，得回归方程：Z316＝－8.422C＋6.571×10－4，r＝0.9994，线性范围为10～40 μg·mL－1，见表2。

图2 3 种稀释液的一阶导数光谱图Fig 2 First derivative spectra of three dilutions

表2 马来酸噻吗洛尔的紫外光谱数据Tab 2 UV spectrum data of timolol maleate

2.7 方法学验证

2.7.1 回收试验 精密称取105 ℃干燥至恒重的马来酸噻吗洛尔，按处方量分别配制相当于标示量为80%、100%、120%的样品溶液，各3 份，按“2.6”项下方法进行紫外分光光度法测定，结果标准曲线法平均回收率为96.8%，RSD为2.0%；吸收系数法平均回收率为97.1%，RSD为2.1%；双波长法平均回收率为96.1%，RSD为2.3%；一阶导数法平均回收率为94.6%，RSD为4.3%。4 种方法均符合药物质量控制分析方法的要求。

2.7.2 精密度试验 将“2.7.1”项下配制的100%样品溶液，于同一日内每批测定5 次，计算日内精密度；连续测定5 d，计算日间精密度。结果标准曲线法、吸收系数法、双波长法、一阶导数法日内精密度RSD分别为1.6%、1.6%、1.6%、0.0%；日间精密度RSD分别为2.2%、2.6%、1.3%、0.0%。

2.8 样品含量的测定

按照“2.6”项下方法，分别测定3 个批次样品中马来酸噻吗洛尔含量，结果见表3。4 种方法均可对血管瘤乳膏中马来酸噻吗洛尔进行定量测定。

表3 4 种方法测定3 批样品含量结果比较Tab 3 Content determination of 3 batches of samples by 4 methods

3 讨论

血管瘤乳膏为本院自制制剂，用于婴幼儿血管瘤的治疗，弥补了无市售噻吗洛尔凝胶或乳膏制剂的不足。血管瘤乳膏中马来酸噻吗洛尔含量对治疗效果影响很大，故建立血管瘤乳膏中马来酸噻吗洛尔的含量测定方法尤为重要。

马来酸噻吗洛尔在乙醇中略溶，且测定波长选择在298 nm、316 nm 及330 nm，均大于乙醇截止使用波长，符合紫外-可见分光光度法对溶剂的要求。

紫外分光光度法根据样品的吸光度对波长的变化规律来进行定性和定量分析，应用紫外分光光度法对共存组分进行不分离定量测定时，通常采用的方法有双波长法、三波长法、导数光谱法等，笔者选择使用标准曲线法、吸光系数法、双波长法、一阶导数法分别对其进行含量测定。结果，4 种测定方法回收率、精密度都在可控范围内，符合药物含量测定要求，均可用于血管瘤乳膏中马来酸噻吗洛尔的含量测定。

由于受乳膏基质吸收的影响，在进行含量测定时，标准曲线法及吸收系数法要扣除空白乳膏基质的吸收才能进行计算，每次需另行配制空白乳膏并制备乳膏基质溶液，操作繁琐。双波长法利用测定波长和参比波长的差值绘制标准曲线，可以同时测定互有干扰的两个组分，消除空白辅料的干扰，方便简洁。一阶导数法采用微分求导，可以在谱图上显示出微小的变化，不仅具有双波长法测定的上述优点，而且可以提高光谱图的分辨率，具有灵敏度高、专属性强、操作方便、结果准确等优点，具有较大的优越性。