细胞外基质在糖尿病足溃疡防治研究中的应用进展

王轩宇，阙华发（1.上海中医药大学，上海 200032；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

据报道，全世界约有4.15 亿人患有糖尿病，另约有1.93 亿潜在糖尿病患者未被诊断[1]。我国成人糖尿病患者人数已超过1.14 亿[2]。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是一种严重的糖尿病并发症，糖尿病患者终生患脚溃疡的风险高达25%[3]。DFU 患者截肢率和死亡率高，死亡率约为未患有DFU 的糖尿病患者的两倍[4]。DFU 复发率高，3年后复发率大于50%[5]。糖尿病患者因局部缺血、神经病变、感染等因素协同作用而导致足溃疡发生。此外，年龄、性别、吸烟史、足部温度等因素也影响DFU 的发生发展[6-8]。目前，DFU的外治主要以局部清创和新型敷料为主，但由于其发病机制尚不明确，临床治疗缺乏靶向性，因此DFU 仍然是慢性难愈性溃疡领域的重大挑战。

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是由胶原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和其他糖蛋白组成的非细胞三维高分子网络[9]。既往的研究中，人们常注重探究细胞内环境和成分的改变对疾病的影响，而ECM 对疾病的影响不够重视。随着细胞分离技术和分子生物学的进步，人们逐渐认识到ECM 不仅是支持细胞的框架，还提供重要的生物化学与生物物理学信息，对细胞形态、生长、分裂、分化和凋亡起重要的调控作用。当前，ECM 已证实与免疫、炎症、创面愈合、血管生成、恶性转化等密切相关[10]。近年来，国内外研究发现ECM 在DFU 的发生、发展及转归中起到了重要作用。本文对一些主要ECM 组分及其相关酶类与抑制剂在DFU 的发生与修复中的作用与可能机制进行重点综述。

1 ECM 稳态在DFU 创面愈合中的作用

ECM 是一种高度动态的结构网络，其蛋白组分与相关酶类以及酶类相关抑制剂的组成、含量、形态结构以及生物活性共同构成ECM 稳态，是细胞微环境的重要组成部分。维持ECM 稳态无论是在组织发育还是在组织的疾病与再生中都至关重要，因而越来越受到重视。DFU 创面愈合既涉及细胞迁移、增殖与分化，也涉及ECM 沉积和重塑等生物学过程。在DFU 微环境中，深入探究ECM 稳态重塑在DFU 伤口愈合的作用与机制可为以ECM为分子靶标的DFU 治疗策略提供新的研究方向。

DFU 进展特征区别于普通创面愈合过程，表现为炎症期延长，增殖期有限，重塑不规则等[11-13]。ECM 作为结构支撑和细胞相互作用的重要媒介，是创面愈合的关键促进者。在伤口愈合过程中，断裂的原纤维被ECM 酶降解，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），包括胶原酶和明胶酶等，新的ECM 原纤维也被合成和修饰来实现肌肉等组织再生[14-15]。即ECM 重构涉及ECM 退化、产生和成熟之间的平衡，以及MMPs 和金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的平衡。而在DFU 伤口愈合过程中，涉及的炎症因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等过度分泌以及ECM 调控基因、ECM 相关酶类异常表达，平衡倾向于产生更多降解的、不可溶性的原纤维，导致ECM 稳态紊乱。DFU 中主要ECM及其相关酶类的变化情况见表1及表2。

表1 DFU 进程中主要ECM 分子的变化情况Tab 1 Change of major ECM components in the DFU process

表2 DFU 进程中ECM 相关酶类及其抑制剂的变化情况Tab 2 Change of ECM related enzymes and their inhibitors in the DFU process

在糖尿病中，高糖环境和其他变化引起炎症因子过度释放及氧化应激性损伤，MMPs 的产生增加，高表达的MMPs 进一步加重炎症，同时MMPs/TIMPs 比值增加，导致ECM 稳态改变，ECM 片段过度累积[27-28]。此外，高糖导致糖基化引起晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的蓄积也会改变ECM 的结构和功能，糖基化导致分子间交联的形成，这显著改变了ECM 的生物力学特性，并导致真皮成纤维细胞的细胞周期停滞和凋亡[29-31]。而ECM 的病理状态，进一步影响细胞黏附与增殖及细胞正常生物功能，导致DFU 创面经久难愈。ECM 稳态在DFU 中的作用模式见图1。

图1 ECM 稳态在DFU 进程中的作用模式示意图Fig 1 Mode of ECM steady state in the DFU process

2 ECM 及其酶类在DFU 治疗中的作用

2.1 ECM 在DFU 治疗中的作用

透明质酸（hyaluronan，HA）是皮肤ECM的主要成分，以酯化的形式存在于许多真皮基质中。HA 在创面愈合的增殖阶段影响细胞的迁移、增殖、炎症反应和血管生成等多种过程，在伤口愈合和组织修复过程中处于关键地位[32]。Lee等[33]为了确认HA 在DFU 治疗中的唯一有效性，使用不含其他物质的HA 敷料进行了一项前瞻性研究，将34 位患者随机分为HA 敷料组和常规敷料组两组，发现HA 敷料组的完全治愈率显著高于常规敷料组，溃疡愈合速度更快。这些研究显示，HA 作为ECM 的主要成分，纯外源性HA 敷料治疗DFU 有效。

胶原蛋白（collagen）是一种主要ECM 组分，也是皮肤的重要组成部分，可促进成肌纤维细胞分化与纤维化，从而保留天然ECM 结构并促进愈合[34]。Colak 等[35]将64 例Wagner 2 级或以上DFU 患者分为胶原组（34 例）和生理血清组（30例），治疗12周后，生理血清组17例患者（56.6%）完全愈合，胶原组25 例完全愈合（73.5%）。与生理血清组相比，胶原蛋白组平均愈合时间更短、创面愈合率明显更高，提示在DFU 的治疗中使用胶原蛋白敷料可以有效缩短愈合时间。

2.2 以ECM 酶类为靶点的DFU 防治

MMP-9 等酶高表达及MMPs/TIMPs 比例失衡是导致DFU 创面难愈的主要原因，以MMPs为靶标设计抑制剂有望成为DFU 防治新策略。ND-336 能选择性抑制MMP-9，同时不影响MMP-8 活性，可通过降低炎症，增强血管生成和使伤口重新上皮化来加速糖尿病伤口的愈合，从而逆转病理状态，有效促进DFU 创面愈合[36]。ND-336 和活性重组MMP-8 复合物的局部应用进一步增强了愈合效果，这一策略在DFU 的愈合中具有很大的前景[37]。

高选择性MMP 抑制剂已被证实在DFU 的治疗中具有巨大潜力。然而，MMPs 之间结构的相似性使得选择性MMPs 抑制剂的药物设计极具挑战。随着多组学及生物信息学技术进步，应用于靶标和药物间关联网络药理学的构建，结合分子对接技术进行高精度预测，可为寻找高特异性的MMPs 抑制剂提供解决方案。

3 ECM 稳态在DFU 创面愈合中可能的机制

ECM 通过连接特定的跨膜受体，激活或改变细胞形态和细胞骨架动力学特性，影响细胞内信号传导，从而调节细胞的生长、迁移和细胞命运，介导多种生理和病理过程。伤口愈合是一个复杂的生物学过程，涉及复杂的ECM 分子和细胞间的相互作用。目前，缺乏DFU 的发病机制制约了人们对ECM 在DFU 创伤愈合中的理解，现有研究主要集中在ECM 组分及其酶类变化导致DFU创面难愈，以及ECM 相关成分防治DFU 有效性与安全性的评价，而关于ECM 分子在DFU 的作用机制缺乏深入研究，本文综合当前的研究结果，将ECM 稳态在DFU 中可能的机制进行以下探讨。

3.1 新生血管生成

血管生成在伤口愈合中起核心作用，新生血管生成机制受损是DFU 伤口难以愈合的主要因素。ECM 包括基质蛋白及其降解性金属蛋白酶，是微环境的主要组成部分，在血管重塑过程中表现出复杂的动态变化[38]。基底膜（BM）是ECM中的细腻、纳米级和柔软的薄片，它直接影响皮肤完整性和神经肌肉结构，从而影响皮肤脂肪形成和纤维化[39]。BM 是支撑毛细血管形态结构和维持血管动态平衡所必需的物质。通过去除包含生长因子的细胞成分和脂质残留物纯化获得的无细胞脂肪提取物（cell-free fat extract，Ceffe），能显著促进体外培养的真皮成纤维细胞的增殖。在小鼠皮肤中，Ceffe 显著增加了真皮的厚度、增殖细胞的数量和毛细血管的密度[40]。骨ECM-仿生纳米纤维系统显著改善了内皮细胞的附着和增殖，并上调血管生成标记（CD31）的表达，其在体内还通过上调低氧诱导因子-1α（Hif-1α），血管内皮生长因子（VEGF），胶原蛋白1（Col1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的mRNA 和蛋白表达，显著促进了血管生成、肉芽组织形成以及胶原基质重塑和表皮分化，从而有效促进糖尿病伤口的愈合[41]。可见，DFU 组织内ECM 合成与降解的失衡影响血管生成和毛细血管完整性可能是导致创面难愈的主要原因，外源性ECM 对DFU 新生血管形成有积极意义。

3.2 氧化应激水平

氧化还原信号通过影响ECM 的结构与功能调节伤口愈合。糖尿病中正常的氧化还原信号被破坏，导致自由基（如ROS）生成和清除之间关系失衡。研究发现DFU 患者的病灶周围皮肤组织处于严重的氧化应激状态，皮肤核因子-E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）介导的抗氧化反应活性降低，氧化性DNA 损伤增加[42]。临床标本检测结果表明，与对照组相比，DFU 组组织中过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（NO）含量增加，高糖水平可能通过激活PKCβ-p66shc 途径诱导细胞和组织氧化应激损伤[43]。

3.3 细胞行为与功能

骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）募集减少，成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移降低是DFU 愈合不良的主要特征。ECM 对这些细胞的功能与行为产生重要影响。ECM 连接特定的跨膜受体，激活改变细胞形状和细胞骨架动力学的细胞内信号传导，从而调节细胞的生长和活力、细胞迁移，对塑造发育和协调组织行为至关重要。体外研究表明纤连蛋白能保持EPCs 干细胞特征并扩增，而明胶和胶原蛋白则将EPCs 导向成熟的内皮表型，这些ECM 可通过调节EPC 为骨髓重建和新血管生成提供条件[44]。外源性胶原蛋白膜能促进成纤维细胞迁移[45]。HA 由成纤维细胞与角质形成细胞动态产生，细胞外HA 与细胞表面受体CD44 的相互作用在这些细胞生理中起重要调节作用[46]。可见，DFU 环境下的ECM 组成和结构的紊乱损害了细胞行为与功能，引起损伤局部组织稳态失衡，最终造成愈合困难。

3.4 炎性细胞因子水平

糖尿病患者体内长期高血糖发挥累积作用，导致感染后炎症细胞因子水平升高，细胞毒性介质分泌增加，从而导致持续的炎症状态和伤口上皮功能异常[47]。DFU 创面组织MMPs 分泌增加，其水解产物ECM 片段增多。而大量ECM 片段及其受体与体内炎症发生显著有关[48]。此外，在炎症过程中ECM 片段表达上也可以激活免疫细胞，从而使炎症反应持续发生[49]。这种异常表达的ECM 与炎症反应之间相互影响、相互促进作用模式导致DFU 创面长期在较高的炎症水平，以致迁延难愈。

3.5 生长因子水平

生长因子是一类生物活性多肽，包括血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）等，影响多种细胞的增殖和迁移，成纤维细胞和炎症细胞的血管生成和趋化，在加速和促进伤口愈合过程中起着重要作用，生长因子也有助于防止细胞凋亡，并影响ECM 的产生和重塑[50]。糖尿病患者VEGF-A 和胎盘生长因子（PlGF）等生长因子表达水平与DFU的发生成负相关[51]。ECM 有利于维持生长因子活性，DFU 创面组织ECM 稳态遭到破坏，导致生长因子受体的调节降低和生长因子的快速退化，从而影响患者伤口愈合。

4 问题与展望

长期以来，人们普遍倾向于将ECM 简单视为一种结构组分，将机体重要病理生理改变解释归于单纯的细胞功能与活动的变化。随着对ECM的机械性能与生物力学研究的逐渐深入，以及对整联蛋白、CD44、盘状蛋白结构域受体等细胞表面受体的广泛研究，人们对其与细胞之间的复杂相互作用逐渐有了清晰认识，明确了ECM 组分调节信号级联与细胞骨架构型等功能在细胞形态发生和稳态维持等方面的重要性，强调了其在急慢性创面愈合中的关键作用。靶向ECM 组件（例如蛋白聚糖和糖胺聚糖，MMPs 和TIMPs 等）有望成为慢性难愈性创面修复创新防治的新策略。

目前，DFU 的治疗主要有伤口清创，减压，重塑血管和防治感染等方法。除这些传统疗法外，新的治疗方法如重组生长因子，皮肤替代品，细胞因子刺激物或抑制剂，MMPs 抑制剂，神经肽，血管生成刺激物等[52]，以及未来的治疗策略包括干细胞的疗法，基因疗法，应用血管紧张素受体类似物等已成为DFU 防治研究的热点。这些新型DFU 的治疗方法中，通过干预生长因子、炎性因子、MMPs、血管生成以及干细胞等疗法需要通过调节ECM 组件或ECM 功能支持来实现。提示，ECM 组件在DFU 的传统或新型疗法中都起着举足轻重的作用，以ECM 为靶点的DFU 防治研究具有重要学术意义与应用价值。

然而，目前掌握的有关蛋白酶和生物活性ECM 片段数据是有限，另外蛋白酶和ECM 片段通常存在时间短，且局部浓度低，因此，尚缺乏对ECM 完整的生物学信息的了解[53-54]。此外，ECM 的特定受体、ECM-受体间相互作用机制研究均不够充分，ECM 稳态失衡引起细胞外微环境的改变是如何调控细胞的生长，代谢，迁移，增殖和分化等生命活动，以及调节组织或器官的功能机制尚未阐明。因此，缺乏对ECM 完整的生物学信息的了解，局限了ECM 对DFU 作用及其机制的诠释。随着先进检测与分析技术的快速进步，如基于定量蛋白质组学、转录物组学、表观遗传学等方法，通过组织质谱、双光子显微镜和低温电子显微镜，以及基于衍射和X 射线的光谱技术，能准确而有效地分析低丰度物质的时空分布，有助于系统地诠释ECM 功能与活动，以及细胞-ECM 间复杂的生物学作用。这些方法可以应用于ECM 在DFU 中作用与机制研究，为开发更有效的DFU 防治策略提供新的思路与方向。