UPLC-Q-TOF-MS分析畲药地菍的化学成分

曹丹，赵崇军，王海燕，卫博文，蒋杨雨，林瑞超*，李健*（.北京中医药大学中医学院，北京0488；.北京中医药大学中药学院，中药品质评价北京市重点实验室，北京 0488）

地菍别称地稔、地茄子、地葡萄、铺地锦等，为野牡丹科野牡丹属植物地菍（Melastoma dodecandrumLour.）的干燥全草。民间使用广泛，为畲族常用药材，畲民多称嘎狗噜或粪桶板[1]。地稔具有清热化湿、祛瘀止痛、收敛止血之功效。现代药理研究表明，地菍提取物有镇痛消炎、降血糖、调血脂、止血、抗氧化、抗肝炎等作用[2-4]。地菍含有多种化学成分，主要有黄酮类、甾体类、萜类、鞣质、多糖类、有机酸等化合物[5]。然而，目前关于地菍有效成分的深入研究相对较少，因此，针对地菍建立快速的分析方法，对于地菍药理活性物质的深入研究及开发利用具有重要参考价值。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）具有高分辨率、高灵敏度和高分离度等优点，可在缺少对照品的情况下对复杂中药成分进行定性分析，近年来已迅速成为中药材成分分析领域的重要研究方法[6]。本文采用UPLC-Q-TOF-MS 技术结合UNIFI 天然产物数据库，对地菍提取物中小分子成分进行快速、全面的分析，为进一步提升地菍药材的质量控制和阐明药效物质基础提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity UPLC I-Class 超高效液相色谱仪、Q-TOF MS 串联飞行时间四级杆质谱仪（Waters 公司），BT224S 型电子天平（赛多利斯科学仪器）。

1.2 试药

地菍（采自福建，批号：20140421，经北京中医药大学中药鉴定教研室刘春生教授鉴定野牡丹科植物Melastoma dodecandrumLour.的干燥全草）。乙腈（色谱纯，Fisher），甲酸（分析纯，北京化工厂），亮氨酸-脑啡肽（对照品，Sigma 公司），水为娃哈哈纯净水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相：乙腈（A）～0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～1 min，2%A；1～10 min，2%～30%A；10～12 min，30%～100%A；12～13 min，100%A；13～13.5 min，2%A；13.5～15 min，2%A），柱温：40℃；流速：0.4 mL·min－1；进样量：5 μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压：正离子模式3.0 kV，负离子模式2.5 kV；锥孔电压：40 V；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：450 ℃；锥孔气：150 L·h－1；脱溶剂气：800 L·h－1；实时校正标准物：亮氨酸脑啡肽（[M ＋H]＋＝556.2771，[M-H]－＝554.2615）。

2.3 供试品溶液的制备

取地菍粉末（过60 目筛）4.0 g，精密称定，置250 mL 圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流提取3 h，放冷至室温，再称定质量，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，取5 mL 置10 mL 量瓶中，加蒸馏水至刻度，13 000 r·min－1离心5 min，上清液即为供试品溶液。

2.4 数据处理及谱库检索方法

采用UNIFI 软件对正、负离子模式下地菍提取液LC-MS/MS 的Raw data（MSe 采集模式，含全部一级、二级质谱峰信息）进行分析，结合已报道的化学成分建立地菍成分数据库，检索Waters UNIFI 软件中天然产物数据库，UNIFI 软件通过母离子的精确质量数、同位素峰度模型、子离子精确质量数等参数自动匹配中药数据库里已有化合物，误差小于5 ppm，至少匹配上1 个子离子，且一级质谱响应值大于10 000 筛选鉴定结果，软件自动产生提取离子流图、一级质谱匹配结果和二级碎片匹配结果。

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS 分析地菍提取液总离子流图

采用UPLC-Q-TOF/MS 对地菍提取液的化学成分进行定性分析，得到地菍提取液（＋）ESIMS 和（－）ESI-MS 的质谱总离子流图（见图1）。

图1 正（A）、负（B）离子模式下地菍提取液总离子流图Fig 1 Total ion chromatogram of Melastoma dodecandrum Lour.extraction in positive（A）and negative（B）ion mode

3.2 地菍化学成分的结构鉴定

通过查阅文献[7-25]、使用UNIFI 软件对正、负离子模式下地菍提取液LC-MS/MS 的Raw data（MSe 采集模式）进行分析，检索Waters UNIFI 软件中天然产物数据库，结合文献资料、Chemspider等数据库以及质谱裂解规律等，推断可能的化学成分及其裂解过程，对地菍的化学成分结构进行分类，并对主要碎片离子信息进行归属，结果见表1。

表1 地菍化学成分鉴定结果Tab 1 Identification of chemical constituents of Melastoma dodecandrum Lour.

3.2.1 黄酮类成分裂解规律分析 黄酮类化合物在MS/MS 正离子模式下，易得到[M ＋H]＋的分子离子峰。黄酮苷会失去糖基产生[M ＋H-glc]＋的特征性苷元碎片离子，游离的黄酮苷元主要有两种裂解方式，方式Ⅰ：苷元C 环的逆-狄尔斯-阿尔德反应（RDA）裂解产生m/z153 和m/z134的碎片离子；方式Ⅱ：苷元还可以裂解产生m/z137 和m/z109 质谱碎片信息。以木犀草素-7-O-葡萄糖苷为例，对黄酮类化合物质谱裂解规律进行探讨，木犀草素-7-O-葡萄糖苷可能的裂解途径如图2所示，与文献[7]木犀草素-7-O-葡萄糖苷对照品碎片一致，推测峰13 为木犀草素-7-O-葡萄糖苷。

图2 木犀草素-7-O-葡萄糖苷裂解途径Fig 2 Fragmentation pathway of luteolin-7-O-glucoside

峰6、11、15～20、22～25 为黄酮或黄酮醇类化合物，正/负离子模式下，分子离子峰m/z依次是611.1594 [M ＋H]＋，595.1277 [M ＋H]＋，447.0923 [M ＋H]＋，449.1071 [M ＋H]＋，617.1133 [M ＋H]＋，609.1445[M-H]－，465.1036[M ＋H]＋，433.1133 [M ＋H]＋，433.1135 [M ＋H]＋，465.1021 [M ＋H]＋，595.1657 [M ＋H]＋，287.0549 [M ＋H]＋，黄酮苷失去糖基后，形成的黄酮苷元易产生正离子模式m/z153，负离子模式m/z151 及m/z109 的特征碎片，结合文献[7-14]，推测峰6、11、15～20、22～25 依次为nelumboroside A、山柰酚-3-O-鼠李糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（峰13 的同分异构体）、desmanthin-1、芦丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、牡荆素、异牡荆素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（峰19 的同分异构体）、山柰酚-3-O-刺槐二糖苷和山柰酚。

峰7 的分子离子峰为m/z593.1293 [M-H]－，二级扫描产生m/z305.0661 [M-H-C15H13O6]－，m/z287.0543 [M-H-C23H21O8]－，m/z153.0188 [C7H5O4]－等特征峰，查阅文献[15]，推测其为表没食子儿茶素（4，8）-没食子儿茶素。峰10 的分子离子峰为m/z457.0772 [M-H]－，二级扫描产生m/z169.0141 [C7H6O5]－的特征峰，查阅文献[16]，推测其为表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯。

3.2.2 鞣质类成分裂解规律分析 鞣质是由没食子酸葡萄糖（多元醇）酯或其衍生物聚合物组成的多元酚。其MS/MS 易失去H2O、CO2、CO和glc 等碎片峰，通过失去六羟基联苯二甲酰基（HHDP，m/z301），没食子酰基（-galloyl，m/z152）而发生裂解，HHDP 和没食子酸（m/z169）也是鞣质的特征碎片。以casuarinin 为例，推测鞣质类化合物可能的裂解途径（见图3），峰12在负离子模式下，其分子离子峰为m/z935.0798[M-H]－，失去一分子H2O 产生碎片离子917.0691[M-H-H2O]－，失去一分子HHDP 产生633.0734[M-H-HHDP]－的碎片离子，失去一分子没食子酰基产生153.0179 [-galloyl]－的碎片，查阅文献[10]，推测其为casuarinin。

图3 Casuarinin 的裂解途径Fig 3 Fragmentation pathway of casuarinin

峰4 的分子离子峰为m/z783.0686 [M-H]－，失去一分子H2O 产生碎片离子765.0578 [M-HH2O]－，二级扫描产生481.0631 [M-H-HHDP]－和没食子酸169.0140 [C7H5O5]－的碎片离子，查阅文献[17]，推测其为英国栎鞣花酸。峰5 的分子离子峰为m/z783.0688 [M-H]－，二级扫描产生603.0636 [M-H-C8H5O5]－，481.0621 [M-HHHDP]－，300.9989 [HHDP]－的碎片离子，查阅文献[18]，推测其为二逆没食子酰基葡萄糖。峰9 的分子离子峰为m/z933.0716 [M-H]－，二级扫描产生915.0691 [M-H-H2O]－，783.0684 [M-Hgalloyl]－，631.0738 [M-H-HHDP]－的碎片离子，查阅文献[19]，推测其为栗木鞣花素。峰14 的分子离子峰为m/z937.0924 [M-H]－，二级扫描产生785.0745 [M-H-galloyl]－，300.9987 [HHDP]－查阅文献[20]，推测其为tellimagrandin Ⅱ。峰21的分子离子峰为m/z951.0896 [M-H]－，失去1 分子H2O 产生933.0637 [M-H-H2O]－， 结合300.9992 [HHDP]－和169.0142 [C7H5O5]－的特征碎片，查阅文献[21]，推测其为老鹳草素。

3.2.3 有机酸和其他成分裂解途径推测 峰2 的分子离子峰为m/z331.0671 [M-H]－，二级扫描产 生211.0250 [M-H-C4H9O4]－，169.0142 [M-Hglc]－等特征峰（见图4），查阅文献[10]，推测其为单没食子酰葡萄糖。

图4 单没食子酰葡萄糖的裂解途径Fig 4 Fragmentation pathway of galloylglucose

峰3 的分子离子峰为m/z169.0134 [M-H]－，二级扫描产生125.0235 [M-CO2]－特征峰，查阅文献[10]，推测其为没食子酸。峰8 的分子离子峰为m/z355.0304 [M-H]－，二级扫描产生169.0141[M-H-C7H6O6]－特征峰，查阅文献[22]，推测其为诃子次酸。峰26的分子离子峰为m/z717.1457 [MH]－，二级扫描产生519.0924 [M-H-C9H11O5]－，321.0403[M-H-C18H21O10]－，161.0246[M-HC27H25O13]－等特征峰，查阅文献[23]，推测其为丹酚酸B。

峰27 的分子离子峰为m/z453.3353 [M ＋H]＋，二级扫描产生261.1840 [M ＋H-C13H19O]＋，219.1744 [M ＋H-C15H21O2]＋等碎片离子，查阅文献[24]，推测其为灵芝酸S。峰28 的分子离子峰为m/z517.3173 [M-H]－，二级扫描产生485.3381[M-H-OH-CH3]－，471.3114 [M-H-COOH]－，171.1023 [C9H15O3]－等特征峰，查阅文献[25]，推测其为2-羟基商陆酸。

峰1 的分子离子峰为m/z665.2199 [M-H]－，二级扫描产生647.2039 [M-H-H2O]－，485.1512[M-H-rha]－，179.0558 [C6H11O6]－等特征峰，查阅文献[26]，推测其为水苏糖。

4 讨论

目前，关于地菍的化学成分研究较少，查阅已报道的文献[5]，仅分离纯化得到78 个化合物。为进一步分析地菍中的化学成分，本课题组前期已分析鉴定出地菍中109 种物质[10]，通过比对发现本次试验中有6 个成分（没食子酸、单没食子酰葡萄糖、牡荆素、芦丁、casuarinin 和山柰酚）与文献[10]报道一致。本文采用了与之不同的提取方式，提取的化合物多以极性成分（鞣质、黄酮苷、酚酸等）为主，既对已分离得到的地菍中化合物进行了验证，又补充和丰富了地菍中的化学成分，为完善地菍药材质量标准提供了参考。

比较正、负离子模式下的地菍提取液总离子流图发现，黄酮类化合物的一级质谱中正离子模式下的响应优于负离子，且正离子模式下其MS/MS 碎片更为稳定、更具有特征性，因此，选择正离子模式下对黄酮类进行分析；鞣质和酚酸类物质在一级质谱中负离子模式下的响应优于正离子，在负离子模式下碎片较为丰富，特征碎片强度较高，因此，选择在负离子模式下对鞣质和酚酸类进行分析，故本文同时选择正、负离子模式对地菍的化学成分进行数据采集。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技术， 通过检索Waters UNIFI 软件中天然产物数据库、Chemspider 数据库等，结合文献资料以及质谱裂解规律，初步鉴定出28 个化学成分，包括15 个黄酮、6 个鞣质、4 个酚酸、2 个三萜和1 个寡糖，其中16 种成分为首次在地菍中发现。由于天然产物数据库质谱信息有限和质谱无法鉴定同分异构体，本研究尚有含量较高成分未指认，需进一步分离鉴定，增加对照品进行验证，也为未来继续研究地菍中新成分提供了方向。