京尼平苷对UVA诱导HSF细胞凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响

陈巧云，杨柳，刘斌，李文鹏，李伟，谷建梅，黄昕红，尤棵，王业秋

（黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007）

随着全球经济的飞速发展，臭氧层破坏加剧，辐射到地球表面的紫外线（Ultraviolet Ray，UV）日益增多。皮肤是UV 作用于人体的主要靶器官，长期的UV 照射可使其结构、功能发生改变，导致光老化的发生，出现粗深皱纹、皮肤下垂、色斑等临床表现［1］。到达地表的紫外线中，长波紫外线（UVA，320 nm～400 nm）占总量的95%，且穿透力强，能直接损伤皮肤真皮层的成纤维细胞，导致成纤维细胞功能紊乱，是引起皮肤光老化的主要因素［2-3］。

国内外学者针对UV 损伤皮肤的机制及皮肤光老化的预防和治疗进行了大量研究，取得了一定效果，但远远满足不了临床需求［4-5］。本课题组在杜仲抗皮肤光老化的药效物质基础研究中发现，京尼平苷（geniposide，GP）是杜仲抗皮肤光老化的活性物质之一，能减轻UVA 损害皮肤成纤维细胞［6］。本实验主要研究GP 对皮肤成纤维细胞活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的清除、细胞凋亡率以及细胞凋亡相关蛋白p53、Bax、Bcl-2 mRNA 表达的影响，探讨GP 抗皮肤光老化的机制，为皮肤光老化的防治及GP的进一步研究提供理论基础。

1 材料

1.1 细胞

人皮肤成纤维细胞HSF（上海艾研生物科技有限公司）。

1.2 药物与试剂

DMEM 培养基、胎牛血清［赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司］；ROS 检测试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）测试盒、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；引物、SGExcel UltraSYBR Mixture、AMV 第一链cDNA 合成试剂盒［生工生物工程（上海）有限公司］；京尼平苷（上海锐谷生物科技有限公司）。

1.3 仪器

紫外照射仪（Sigma 公司）；紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂）；流式细胞仪（HPC-150 型，加拿大Handyem公司）；实时荧光定量PCR仪（MX3000P型，美国安捷伦公司）。

2 方法

2.1 药物配制

GP 用DMEM 培 养液 配制 成5 × 10-7、5 × 10-6、5 × 10-5mol/L 三个浓度，调整pH 值为7.0，微孔滤膜（0.22 μm）过滤除菌。

2.2 HSF细胞的体外培养及模型建立

HSF 细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培养液，在5%CO2、37 ℃、饱和湿度的环境下培养。将对数生长期的HSF细胞制备成1×106、5×104个/mL的细胞悬液分别接种于6孔板和96 孔板。参考文献［6］和［7］的方法，用20 J/cm2的UVA照射细胞建立光老化模型。

2.3 实验分组

接种于孔板内的细胞随机分为正常对照组、模型对照组和药物处理组，其中药物处理组又分为5×10-7、5×10-6、5×10-5mol/L 三个浓度。①正常对照组：不含GP的DMEM培养液正常培养；②模型对照组：UVA照射建立光老化模型，不含GP的DMEM培养液培养；③药物处理组：UVA 照射建立光老化模型，分别给予含5×10-7、5×10-6、5×10-5mol/L GP的DMEM培养液进行培养。

2.4 MTT法检测细胞活力

接种到96 孔板的细胞，给药干预24 h，每孔加5 mg/mL 的MTT 20 μL，继续培养4 h，弃上清后加入150 μL 二甲基亚砜，室温震荡10 min，充分溶解结晶，置于酶标仪中，检测492 nm 处的吸光度（OD），计算细胞活力。

2.5 细胞中活性氧水平检测

6 孔板中细胞，给药24 h 后，使用流式细胞仪测定细胞内活性氧水平。

2.6 LDH活性检测

96 孔板中细胞，给药24 h 后，收集上清液，检测LDH活性，严格按照说明书进行操作。

2.7 细胞凋亡率检测

6 孔板中细胞，给药24 h 后，使用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

2.8 p53、Bax和Bcl-2 mRNA检测

6孔板中细胞，给药24 h后，提取每孔总RNA；按照第一链cDNA 合成试剂盒步骤要求合成cDNA；以该cDNA 为模板进行实时荧光定量PCR。反应体系：20 μL；反应引物：p53，F 5'-ACCACCATCCACTACAACTACAT-3'、R 5'-CAGGACAGGCACAAACACG-3'；Bax，F 5'-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3'、R 5'-GTGTCCACGGCGGCAATCA-3'；Bcl-2，F 5'-ATCCAATCCTGTGCTGCAT-3'、R 5'-ACGTCCACGTTCTTCATTGT-3'；以β-actin 为内参，采用2-△△Ct法，对p53、Bax和Bcl-2 mRNA进行分析。

2.9 统计学处理

3 结果

3.1 GP对HSF细胞活力的影响

20 J/cm2的UVA 照 射 后，细 胞 活 力 减 弱（P＜0.01），GP 各剂量组能提高细胞活力，5 × 10-6、5 ×10-5mol/LGP 组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 GP对HSF细胞活力的影响（±s）

表1 GP对HSF细胞活力的影响（±s）

注：与模型对照组比较，2）P ＜0.01。

组别正常对照组模型对照组5×10-7 mol/L GP 5×10-6 mol/L GP 5×10-5 mol/L GP n 3 3 3 3 3 OD值0.986±0.1062）0.541±0.059 0.624±0.071 0.792±0.0842）0.881±0.0932）细胞活力（%）100.0 54.9 63.3 80.3 89.4

3.2 GP 对HSF 细胞ROS 相对含量、LDH 活性、细胞凋亡的影响

UVA 照射后，ROS 相对含量增加、LDH 活性和细胞凋亡率升高，与正常对照组相比有统计学意义（P＜0.01），GP 干预后，ROS 相对含量、LDH 活性和凋亡率下降（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 GP对HSF细胞ROS相对含量、LDH活性和细胞凋亡率的影响（±s）

表2 GP对HSF细胞ROS相对含量、LDH活性和细胞凋亡率的影响（±s）

注：与模型对照组比较，1）P ＜0.05，2）P ＜0.01。

组别正常对照组模型对照组5×10-7 mol/L GP 5×10-6 mol/L GP 5×10-5 mol/L GP n 3 3 3 3 3 ROS相对含量（%）100.002）238.67±27.28 207.31±21.35 165.24±18.171）131.55±12.912）LDH活性（U/L）409.74±42.312）972.48±99.25 904.52±89.76 622.39±69.432）519.51±53.472）细胞凋亡率（%）9.32±1.172）25.47±3.61 20.54±2.25 15.59±1.982）12.35±1.362）

3.3 GP对p53、Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响

20 J/cm2UVA 照射后，HSF 细胞p53、Bax mRNA 的表达量显著上升，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；Bcl-2 mRNA 表达量基本没变化，与正常对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；GP 各剂量组可降低p53、Bax mRNA 的表达，提高Bcl-2 mRNA的表达，5×10-6、5×10-5mol/L GP 组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见图1和表3。

表3 GP对HSF细胞p53、Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响（±s）

表3 GP对HSF细胞p53、Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响（±s）

注：与模型对照组比较，1）P ＜0.05，2）P ＜0.01。

组别正常对照组模型对照组5×10-7 mol/L GP 5×10-6 mol/L GP 5×10-5 mol/L GP n 3 3 3 3 3 mRNA相对表达量p53 1.00±0.152）2.47±0.33 2.15±0.31 1.77±0.171）1.38±0.152）Bax 1.00±0.132）2.14±0.29 1.98±0.22 1.56±0.191）1.29±0.162）Bcl-2 1.00±0.122）0.98±0.11 1.34±0.16 1.59±0.221）1.92±0.242）

图1 GP对p53、Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响

4 讨论

京尼平苷又名栀子苷，是一种环烯醚萜类化合物，主要存在于栀子、杜仲等植物中，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种药理作用［8-9］。本课题组前期研究发现尼平苷能提高SOD、GSH-Px 等酶的活性，通过调控MAPK 信号通路，减少炎症细胞因子表达和分泌，抑制基质金属蛋白酶的分泌，提高基质金属蛋白酶抑制因子的分泌来保护UV 损伤的皮肤细胞［6］。为了进一步探究京尼平苷抗皮肤光老化的作用机制，笔者以人皮肤成纤维细胞（HSF）作为研究对象，研究京尼平苷处理UV 照射后的HSF 细胞凋亡相关蛋白mRNA 表达的影响，为皮肤光老化的预防和治疗提供理论依据。

在皮肤光老化的各种机制中，研究比较多的是氧化应激学说，认为皮肤细胞在UV 照射下发生一系列生化反应产生ROS，ROS 既可以直接引起细胞的氧化性损伤，使细胞内的酶类失活；又可以作为第二信使，激活细胞内信号转导级联反应，调控MMPs 基因表达［10-11］。本研究中，20 J/cm2的UVA 照射后，细胞内ROS 相对含量增加，培养液中LDH 活性增强，凋亡率增加，细胞活力下降为正常对照组的54.9%，说明UVA 照射引起HSF 细胞的氧化损伤。GP 干预后，ROS相对含量、LDH 活性和凋亡率降低，细胞活力增加，说明GP 通过提高细胞内氧化系统活力，清除ROS，增加细胞活力，抑制细胞凋亡，拮抗UVA 对皮肤成纤维细胞的损伤。

细胞内过量的ROS会产生大量的凋亡转录因子，引起细胞凋亡［12］。哺乳动物中有一系列凋亡相关基因，比较重要的有胱天蛋白酶（Caspases）家族、Bcl-2 家族、ice 基因、p53基因等。Bcl-2家族是一类癌基因家族，其成员如Bcl-2等抑制细胞凋亡，也被称为存活基因；有的促进细胞凋亡，如Bad、Bax等。Bax与Bcl-2这一对相互拮抗的基因共同对细胞凋亡产生影响［13］。Bax蛋白可破坏线粒体膜的完整性，降低膜电位，增加细胞色素C释放，激活Caspase蛋白家族，诱导细胞凋亡，Bcl-2可维护线粒体膜的完整性，抑制细胞凋亡。以抑癌基因p53为核心的信号通路是UV照射诱发细胞凋亡的关键调控环节［14］。UV照射激活p53基因，表达的p53蛋白与线粒体膜上的Bcl 蛋白家族相互作用，导致细胞凋亡［15-16］。在本研究中，与空白对照组相比，UVA照射后，p53、Bax mRNA 表达量上升（P ＜0.01），Bcl-2 mRNA表达量无明显下降（P＞0.05）。GP 处理后，p53、Bax mRNA 表达量下降，Bcl-2 mRNA 表达量升高（P＜0.05），表明GP 通过下调p53、Bax mRNA 表达，上调Bcl-2 mRNA表达，抑制细胞凋亡。

综上，京尼平苷通过调控光损伤HSF 细胞活力和细 胞 内ROS 含 量、LDH 活 性；调 控p53、Bax 和Bcl-2 mRNA 表达，抑制细胞凋亡相关通路，拮抗细胞的氧化损伤，减少细胞凋亡，防治皮肤光损伤。