培本固疏方对去卵巢大鼠炎性因子、骨生物力学及JNK/p38信号通路的影响

李佳洋，沈沐瑶，孙菁，王馨诣，郭海英*，徐道明，朱媛媛

（1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2. 盐城第一人民医院，江苏 盐城 224006；3. 南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；4. 南通第六人民医院，江苏 南通 226001）

骨质疏松（osteoporosis，OP）是一种常见的全身性骨病，其表现为骨量下降、骨微结构破坏，进而导致骨脆性增加，易发生骨折［1］，绝经后骨质疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）主要病因为雌激素的缺乏［2］，本病严重影响患者生活质量。由于西药治疗骨质疏松存在一定不良反应，开展中医药治疗骨质疏松的研究具有一定意义，目前对OP的中医疗法多以滋补肝肾等治法为主，本课题组结合“络病学说思想”提出“正虚络瘀”的骨质疏松病机关键，并确立了“培本补元、通络固疏”的治则。培本固疏方在临床中治疗骨质疏松疗效较佳。本研究通过去卵巢法建立绝经后骨质疏松模型，观察培本固疏方对其骨生物力学指标、血清炎性因子、JNK/p38通路的影响，以探索培本固疏方治疗PMOP的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康6 月龄未孕SPF 级雌性SD 大鼠36 只，体质量（290 ± 20）g，购于上海西普尔-必凯公司，许可证：SCXK（沪）2018-0006。本实验大鼠饲养在南京中医药大学清洁级动物实验中心，经过南京中医药大学动物实验伦理委员会监督并批准，伦理号：201905A002。

1.2 药物与试剂

以人的6.3倍用量计算大鼠用药等效剂量，制备药物。于南京中医药大学百草堂购入人参、龟甲、鹿角、仙桃草，按比例配伍煎煮浓缩制成相应生药浓度的制剂，低、中、高剂量组分别为1.060 5、2.121、4.242 g/mL；阿仑膦酸钠（阿拉丁）与相应量生理盐水配制成相应浓度的溶液（0.21 mg/mL）；青霉素G钠盐（索莱宝）；水合氯醛（阿拉丁）；大鼠TNF-α、大鼠IL-1β 试剂盒（翼飞雪）；JNK、p38抗体（abcam）。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立

用去卵巢法获得PMOP 大鼠模型。将SD 大鼠随机分为两组假手术组（Sham，n= 6）与手术组（OVX，n=30）。过程于无菌环境操作，麻醉后固定大鼠使其呈俯卧位，OVX 组在双侧背部做切口，翻出卵巢并切除，分层缝合。Sham 组同样在双侧背部切口，但不切除卵巢，而是仅切除卵巢旁少量脂肪。手术后给予后肢肌内注射青霉素8万U/只，密切观察7 d。

1.3.2 分组及干预

将OVX 组大鼠随机分为5 组，每组6 只，即模型组（Model）、培本固疏方低剂量组（Low）、培本固疏方中剂量组（Medium）、培本固疏方高剂量组（High）和阿仑膦酸钠组（Alen）。大鼠常规饲养，每2 周进行称重。手术后第5 周开始对大鼠分组干预，各组均连续灌胃8 周。假手术组与模型组均给予生理盐水1 mL/200 g；培本固疏方低、中、高剂量组分别给予培本固疏方低、中、高剂量制剂1 mL/（200 g·d）（中剂量组相当于人类临床用量100 g 生药/d）；阿仑膦酸钠组给予阿仑膦酸钠 溶 液1 mL/（200 g·d）（相 当 于 人 类 临 床 用 量10 mg/d）。

1.3.3 标本采集及测定

大鼠末次给药结束，禁食24 h 后称重、取材，麻醉方法同造模，腹主动脉抽血处死，收集标本。MEIX-90 双能X 线骨密度仪检测L5腰椎密度；三点弯曲试验仪检测左侧股骨屈服载荷、断裂载荷、刚度；HE切片染色法观察右侧股骨微结构；ELISA 法检测血清TNF-α、IL-1β；Western Blot 法检测右侧股骨JNK、p38。

1.4 统计学处理

本实验结果均为定量资料，采用均数±标准差（±s）表示，用SPSS 22.0进行统计。组间比较采用单因素方差分析，若方差齐，组间多重比较采用LSD 法，若方差不齐，组间多重比较采用tamhane 法，P≤0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 骨密度

与假手术组相比，模型组L5腰椎骨密度显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，低剂量组骨密度上升，但差异无统计学意义，培本固疏方中、高剂量组与阿仑膦酸钠组骨密度均显著升高（P＜0.01），三者间差异无统计学意义。见表1和图1。

表1 各组去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影响比较（±s）

表1 各组去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影响比较（±s）

注：与Sham比较，#P ＜0.01；与Model比较，*P ＜0.01。

组别Sham Model Low Medium High Alen n 6 6 6 6 6 6 BMD（g/cm2）0.270±0.028 0.205±0.018#0.207±0.013 0.253±0.028*0.255±0.023*0.267±0.052*

图1 各组去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影响比较

2.2 骨生物力学

与假手术组相比，模型组屈服载荷、断裂载荷、刚度均显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，低、中、高剂量组、阿仑膦酸钠组的屈服载荷均显著上升（P＜0.01）；低、中剂量组断裂载荷上升但无统计学意义，高剂量组、阿仑膦酸钠组断裂载荷显著上升（P＜0.01，P＜0.001）；低、高剂量组刚度上升但差异无统计学意义，中剂量组、阿仑膦酸钠组断裂载荷均上升（P＜0.05）。见表2和图2。

首先，从表中可以看到在《中国日报》和《纽约时报》中出现最多的是物质过程、关系过程和言语过程。这三个过程主要是一种客观的描述，这也间接反映了新闻报道的客观性与真实性。

图2 各组去卵巢大鼠股骨生物力学的影响比较

表2 各组去卵巢大鼠股骨生物力学的影响比较（±s，n=6）

表2 各组去卵巢大鼠股骨生物力学的影响比较（±s，n=6）

注：与Sham 比较，#P ＜0.01；与Model 比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

组别Sham Model Low Medium High Alen屈服载荷（N）97.500±4.970 56.833±7.305#69.833±2.639 75.167±1.941**82.167±3.125**90.000±1.673**断裂载荷（N）123.000±5.933 94.167±9.827#99.167±9.827 103.667±7.062 111.000±14.199**116.667±7.501***刚度0.341±0.043 0.219±0.063#0.257±0.051 0.278±0.025*0.273±0.066 0.295±0.033*

2.3 骨组织形态学

假手术组骨组织结构完整，大量成熟骨组织，骨小梁（TB）粗细均匀，结构完整，排列致密有序；模型组骨小梁可见面积减少，分布错乱且有断裂、暴露骨髓腔（BM）现象；各个干预组骨小梁逐渐完整，且培本固疏方各组疗效与浓度相关，高剂量优于中、低剂量；阿仑膦酸钠组骨组织结构完整，骨细胞排列较整齐，骨小梁致密，形态结构改善，连续性好。见图3。

图3 各组去卵巢大鼠骨微结构的影响比较（HE，×200）

2.4 血清TNF-α、IL-1β

与假手术组相比，模型组血清TNF-α、IL-1β 含量显著升高（P＜0.01），与模型组相比，低剂量组含量降低但差异无统计学意义，其他各药物组大鼠血清中TNF-α、IL-1β 含量显著降低（P＜0.01），其中培本固疏方中剂量组、高剂量组与西药组之间差异无统计学意义。见表3和图4。

图4 各组去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响比较

表3 各组去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响比较（±s，n=6）

表3 各组去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响比较（±s，n=6）

注：与Sham比较，#P ＜0.01；与Model比较，*P ＜0.01。

组别Sham Model Low Medium High Alen TNF-α（ng/L）23.870±4.516 145.302±5.169#98.015±4.207 75.520±7.668*38.103±6.173*28.920±4.585*IL-1β（ng/L）6.388±0.901 35.501±3.258#28.150±2.392 19.125±1.583*9.750±0.972*9.139±0.975*

2.5 骨组织JNK、p38

与假手术组相比，模型组右侧股骨组织中JNK、p38 蛋白表达量均升高（P＜0.05），与模型组相比，低剂量组骨组织JNK 含量降低但无统计学意义，中、高剂量组、阿仑膦酸钠组骨组织JNK 含量均有所下调（P＜0.05），低、中剂量组骨组织p38 含量下降但无统计学意义，高剂量组、阿仑膦酸钠组骨组织p38 含量下降（P＜0.05）。见表4和图5。

图5 各组去卵巢大鼠骨组织JNK、p38的影响比较

表4 各组去卵巢大鼠骨组织JNK、p38的影响比较（±s，n=6）

表4 各组去卵巢大鼠骨组织JNK、p38的影响比较（±s，n=6）

注：与Sham比较，*P ＜0.05；与Model比较，#P ＜0.05。

组别Sham Model Low Medium High Alen JNK 0.250±0.095 1.057±0.190*1.000±0.400 0.803±0.199#0.687±0.129#0.457±0.101#p38 0.180±0.104 1.033±0.351*0.640±0.030 0.622±0.458 0.503±0.116#0.287±0.130#

3 讨论

PMOP与雌激素缺乏的关系较紧密［2］，炎性反应是骨质疏松病理过程的重要机制。中医药疗法由于疗效较佳与不良反应少等优势，日渐被患者群体所接受［3］。本病主要以肾脾亏虚为本，兼以肝郁、痰凝、血虚等［4］。《读医随笔》［5］中论述：“经络之中，必有推荡不尽之瘀血……元气终不能复”，说明久虚当兼见血瘀，进而导致元气亏虚。笔者针对老年人的生理特点，提出PMOP“正虚络瘀”的中医病机，自拟固本培元、祛瘀固疏的培本固疏方治疗。培本固疏方组方为人参、鹿角、龟甲、仙桃草，临床疗效较好，但其治疗OP的机制尚未发掘。人参具有抗炎、抗氧化作用，可抑制破骨细胞增殖，抑制骨吸收［6-7］，在骨质疏松治疗中，人参常组成复方应用。龟甲与鹿角是较常用的补肾中药，林嘉辉等［8］发现龟鹿联合用药，可下调豚鼠软骨细胞的JNK、p38 水平，使其凋亡得到抑制。目前对于仙桃草应用于骨质疏松的研究较少，但其有效成分中槲皮素、木犀草素等已被证实具有抗骨质疏松能力，高压氧联合仙桃草可促进钙沉积，促进成骨细胞的分化［9］。因此笔者推测，培本固疏方治疗骨质疏松，是通过调节炎性因子，调控JNK/p38通路进行的。

c-jun 氨基活化激酶通路（JNK）、p38 丝裂原蛋白活化激酶通路（p38）是MAPK 通路的两大组成部分，与OP 进程相关，可被IL-1、TNF-α 激活，产生级联反应，JNK（MEKK1/TAK1-MEK47-p-JNK-c-Jun，

CaMK，Semaphorin-3D……），p38（TAK1-MEK3/6-p-p38-NFATc1，MITF，TRAP，CTSK，p65，RANK，STAT1，MIG，MK2），进而诱导破骨前体细胞分化，导致骨量下降［10］。

骨生物力学性能是评价骨骼质量的有力指标［22］。三点弯曲实验中，骨骼受载荷外力作用而产生位移，弹性阶段中，骨组织位移随载荷呈线性成比例增加，撤销载荷后骨组织可恢复原状态，屈服载荷指弹性阶段所能承受的最大载荷。而塑性阶段骨组织已产生结构上的损坏而永久性的变形，当载荷达到极限程度，骨组织发生断裂而产生骨折，断裂载荷指骨断裂前所能承受的最大载荷。刚度是反映骨组织抵抗变形的能力，用弹性阶段的“载荷-位移曲线”的斜率来表示，当斜率越大，骨组织受力产生的位移越小，说明骨强度越大。

目前，PMOP 的国内外研究中，去卵巢大鼠为学术界公认且较多使用的造模方式，而动物模型的造模干预持续时长并无统一标准，多使用3～6 月龄雌性未孕大鼠，且6月龄大鼠的PMOP 模型复制效果优于3月龄大鼠，研究持续时间多为2～3 个月［23］。邓琳课题组［24］的研究发现，去卵巢大鼠的腰椎骨密度较对照组从第6 周即开始下降但无统计学意义，第10 周测量发现去势组骨密度较对照组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，有研究认为术后8 周血清骨代谢指标即出现改变，术后12 周变化更加突出［25］。本研究在保证造模效果的前提下，综合考虑实验成本、结果准确性、大鼠骨形成周期等因素，选取了手术后4 周后为干预开始节点，持续干预8周后测取实验数据。

本研究结果显示，低剂量培本固疏方对大鼠未产生明显的骨质疏松改善作用，而中剂量组与高剂量组大鼠骨密度明显提高，同时骨生物力学反映了各中药剂量组均能不同程度地改善模型大鼠的骨骼质量，染色切片显示其骨微结构明显改善，证实了培本固疏方对骨质疏松大鼠的治疗效果。笔者进一步检测了大鼠血清中炎性标志因子TNF-α、IL-1β 与骨组织JNK、p38蛋白的含量，发现培本固疏方中、高剂量组可以显著下调大鼠TNF-α、IL-1β、JNK和p38的含量。

综上所述，本研究建立了大鼠PMOP 模型，模型组大鼠骨密度降低，骨生物力学指标下降，病理切片见骨小梁排列稀疏、不规律，提示造模成功，其发病机制与JNK/p38 通路上调，TNF-α、IL-1β 异常分泌有关。通过培本固疏方治疗后，中药各剂量组大鼠骨密度增加，载荷能力、刚度明显提高，同时血清中炎性因子TNF-α、IL-1β 含量减低，骨组织中JNK、p38 蛋白表达水平下调。说明培本固疏方治疗OP，可能是通过抑制TNF-α、IL-1β 而实现的，JNK/p38 通路在当中起到重要作用。