不同企业雷公藤多苷片及其主要单体成分药效作用评价△

汪祺，王曼虹，王亚丹，张乐帅，马双成*，文海若*

1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.苏州大学，江苏 苏州 215123

雷公藤多苷片（TPT）由卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.根提取加工制成，具有抗炎和免疫抑制作用，临床主要用于治疗类风湿性关节炎[1]、肾病综合征[2]、红斑狼疮、过敏性紫癜[3]等。其主要成分包括二萜类［雷公藤甲素（TP）］，三萜类［雷公藤红素、雷公藤内酯甲（WA）］和生物碱类（雷公藤晋碱、雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷公藤对醌B）等。

现行国家药品监督管理局局颁标准（WS3-B-3350-98-2011）将雷公藤多苷片中的WA 列为含量测定项，规定含量值不得少于10 μg/片，将TP 列为检查项，含量不得高于10 μg/片，而对其他成分未做明确规定[4]。研究表明，雷公藤多苷片中TP 是毒、效并存的成分，除具有一定肝、肾毒性外，可通过调控炎症介质、活化T 淋巴细胞功能、调节细胞因子和类风湿因子表达、影响基质金属类蛋白酶类和核转录因子-κB（NF-κB）表达水平等机制发挥抗炎作用。此外，雷公藤红素也可通过调节NF-κB 和热休克蛋白70 抑制非特异性免疫应答[5]。而雷公藤中其他成分，如多种生物碱的药效作用目前研究较少。已有研究人员将不同生产企业生产的雷公藤多苷片进行了化学成分指纹图谱与小鼠体内药效学关联，结果发现，成分的差异直接影响该制剂在小鼠体内的抗炎药效[6]。因此，本研究以脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 为体外炎症模型，并以一氧化氮（NO）分泌水平和分化抗原簇86（CD86）表达水平为指标，进一步明确雷公藤多苷片主要成分的药效作用，为阐释雷公藤多苷片的药效物质基础提供实验依据，同时也将为科学合理地规范标准中有效成分的测定限度提供重要的数据支撑。

1 材料

1.1 细胞

RAW264.7 细胞购自中国科学院上海细胞库，本研究所用细胞为第八代。

1.2 仪器与试药

LPS（Sigma 公司）、TP（批号：111567-201404，纯度：99.8%）、WA（批号：111597-200505，纯度：100%）均购自中国食品药品检定研究院；雷公藤红素（批号：B20707，纯度≥98%）、雷公藤春碱（批号：B20704，纯度≥98%）；雷公藤次碱（批号：B20705）均购自上海源叶生物科技有限公司；雷公藤晋碱（批号：E-0715，纯度≥98%）购自上海同田生物技术股份有限公司；雷公藤对醌B（纯度＞98%，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所）。雷公藤多苷片（涉及生产企业：A、B、C、D、E、F、G，此处以字母代表；H为在G企业产品中人为在每66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1，作为药效学评价对照）；DMEM 培养基、胎牛血清（BI 公司）；1%青链霉素混合液、NO 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司）；磷酸缓冲液（PBS，Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma 公司）；cell counting kit-8（cck-8，上海迈基生物科技有限公司）；PE-CD86 抗体（BD pharmingen公司）；利多卡因（Ark Pharm公司）；96 孔深孔板（上海泰坦科技股份有限公司）；96 孔未处理板（NEST 公司）；24 孔细胞培养板（Corning公司）。

NEO ALPHA 131120d 型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；ckx31SF 型倒置显微镜［奥林巴斯（中国）有限公司］；2013-82090 型超净工作台（新加坡艺思高科技有限公司）；3111 型细胞培养箱、900 型超低温冰箱［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；5427R 型高速冷冻离心机、5810R 型孔板离心机、Research plus 型移液器（德国艾本德有限公司）；ME204E/02型电子分析天平（梅特勒-托利多国际有限公司）；Milli-Q Biocel型超纯水系统（默克密理博生命科学有限公司）；DK-S22型恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；2016C 型全温金属浴（海狸生物医学工程有限公司）；FACS Verse型流式细胞仪（美国BD公司）；BCD-216TAM型冰箱（海尔集团）。

2 方法

2.1 细胞活力

处于对数生长期的RAW264.7细胞以3×105个/孔接种于24孔板，于37 ℃、5%CO2的条件下培养24 h后，给予不同质量浓度的单体（TP：2.5～160.0 ng·mL-1；雷公藤红素：31.25～1 000.00 ng·mL-1；雷公藤对醌B：312.5～20 000.0 ng·mL-1；WA：62.5～4 000.0 ng·mL-1；雷公藤春碱、雷公藤次碱和雷公藤晋碱均为312.5～20 000.0 ng·mL-1），来自不同企业的TPT（A～G）质量浓度为0～133.0 μg·mL-1，其中TP 及WA 含量见表1[7]。加样后细胞于37 ℃、5% CO2的条件下继续培养24 h，之后每孔加入CCK-8 检测试剂10 μL，37 ℃避光孵育2 h，并用酶标仪检测各孔450 nm 处的吸光度值（A），根据公式（1）计算细胞存活率。

表1 不同企业TPT中TP质量浓度及作用于RAW 264.7细胞的IC50 μg·mL-1

参考半数抑制浓度（IC50）和细胞活性抑制结果，选择IC50以上的浓度或最大无细胞毒性浓度为最高给药浓度开展后续研究。

2.2 NO水平检测

处于对数生长期的RAW264.7 细胞以3×105个/孔接种于24 孔板，每孔500 μL。细胞于37 ℃、5%CO2的条件下培养24 h 后，分为空白组（无细胞）、阴性对照组（有细胞但未加样）、模型组LPS（0.1 μg·mL-1）组和LPS（0.1 μg·mL-1）组与不同质量浓度受试物共处理给药组，每组6 个复孔，分别添加含受试物的培养液500 μL。TP 的质量浓度为2.5～40.0 ng·mL-1；雷公藤红素质量浓度为62.5～1000.0 ng·mL-1；雷公藤对醌B 质量浓度为62.5～10 000.0 ng·mL-1；WA质量浓度为250～4000 ng·mL-1；雷公藤春碱、雷公藤次碱和雷公藤晋碱质量浓度均为1250～20 000 ng·mL-1，A～H 组TPT 的质量浓度均为4.16～66.50 μg·mL-1。加样后细胞于37 ℃、5%CO2的条件下继续培养24 h，之后每样取50 μL 上清液添加于96 孔板，使用NO 检测试剂盒检测。每孔各添加试剂150 μL和试剂250 μL后混合均匀，使用酶标仪检测各孔540 nm 处的吸光度值。试验平行使用不同浓度的标准品（试剂盒提供）绘制标准曲线，用于计算NO水平。

2.3 CD86检测

细胞接种和分组同2.2 项下。TP 的质量浓度为2.5～40.0ng·mL-1；雷公藤红素为62.5～1000.0ng·mL-1；雷公藤对醌B 62.5～10 000.0 ng·mL-1；WA 250～4000 ng·mL-1；雷公藤春碱、雷公藤次碱和雷公藤晋碱均为1250～20 000 ng·mL-1，C 和D 组的TPT 的质量浓度为4.16～16.63 μg·mL-1，其余各组和H 组TPT 质量浓度均为4.16～33.25 μg·mL-1。加样后细胞于37 ℃、5%CO2的条件下继续培养24 h，之后除去上清液，加入PBS 200 μL 重悬并转移至4 ℃水浴中的96 孔板，在4 ℃条件下1000 r·min-1离心5 min（离心半径为13.5 cm）。移除上清，每样添加稀释后的PE-CD86 抗体（1∶100，PBS）50 μL 后重悬，并于4 ℃孵育20 min（10 min 左右振荡1 次）。之后添加PBS200 μL 并于4 ℃条件下1000 r·min-1离心5 min（离心半径为13.5 cm）。移除上清液，再次添加PBS200 μL后重悬细胞备用。使用流式细胞仪检测藻红蛋白（PE）荧光强度，从而反映细胞CD86表达水平。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 不同企业TPT 和雷公藤主要单体成分对RAW264.7细胞活性的影响

质量浓度为0.52～133.00 μg·mL-1的TPT 与RAW264.7细胞作用24 h后，以CCK-8法检测细胞活力，其所含TP及WA质量浓度（以66.67 mg·mL-1TPT为 计）及IC50见 图1、表1。各企业TPT 对RAW264.7 细胞的IC50排序分别为C＜B＜F＜A＜H＜D＜E＜G。值得注意的是，G 企业的TPT 不含TP，H 是人为在G 企业每66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1的对照组，前者IC50约为后者的77倍；而IC50最低的C 企业TPT 中TP 的含量为各家最低。上述结果表明，TP 含量是影响细胞活力的主要成分之一。但TP含量高低并不完全反映TPT对细胞活力抑制的强弱，TPT 中其他成分可能也对细胞活力有抑制作用。

图1 不同企业TPT对RAW264.7细胞活性的影响（,n=3）

给药24 h 后，不同质量浓度的单体成分对RAW264.7 细胞活力的影响见图2，TP 对细胞活性的抑制作用最强（IC50为26.11 ng·mL-1），其次为雷公藤红素（IC50为618.6 ng·mL-1）、雷公藤对醌B（IC50为8649 ng·mL-1），其余单体成分在质量浓度高达20 μg·mL-1时 对RAW 264.7 细胞活力无影响。

图2 不同雷公藤单体成分对RAW264.7细胞活性的影响（,n=3）

3.2 TPT 中主要单体成分及不同企业TPT 对RAW264.7细胞NO水平的影响

空白和阴性对照组细胞上清液中只检出极低含量的NO，而LPS（0.1 μg·mL-1）与RAW264.7 细胞作用24 h后，可生成大量NO（＞10 μmol·L-1；P＜0.001）。

实验发现，所有企业TPT 均可抑制LPS 诱导的NO水平升高（E企业起效质量浓度为8.31 μg·mL-1，其他企业均为4.16 μg·mL-1）。其中，企业A、C 中TPT 在质量浓度为8.31 μg·mL-1时，企业B、D、E、F 及H 在TPT 质量浓度为16.63 μg·mL-1时可将NO 水平抑制至接近空白对照组水平。G 企业TPT不含TP，对LPS 诱导的NO 水平的抑制作用最弱（图3）。

图3 不同企业TPT对NO水平的影响（,n=6）

TPT 中主要单体成分雷公藤红素、雷公藤对醌B 分别自62.5、625.0 ng·mL-1起，对LPS 诱 导的NO生成水平产生抑制作用，该变化差异有统计学意义（P＜0.001），且随单体质量浓度增加抑制效应更加明显；此外，TP 质量浓度为40 ng·mL-1时也可抑制LPS 诱导的NO 水平升高（P＜0.001，图4）。其余单体成分在当前给药浓度范围内对LPS 诱导的NO水平升高无影响。表明现行质量标准中含量测定项WA 单体并无明显抗炎活性，活性较强的成分为雷公藤红素及雷公藤对醌B。

图4 TPT主要单体成分对NO水平的影响（,n=6）

3.3 TPT 中主要单体成分及不同企业TPT 对CD86表达水平的影响

使用流式细胞术检测不同受试物对RAW264.7细胞表面标志物CD86 的影响，并以平均荧光强度（MFI）作为评价指标。空白和阴性对照组的背景荧光强度较低，RAW264.7细胞经LPS（0.1 μg·mL-1）刺激后，细胞表面CD86 的表达量显著增加（MFI＞500，P＜0.001）。不同企业制剂中（图5），除G 企业外，其他企业和H 组的TPT 均可抑制LPS 诱导的CD86 表达水平升高（F 企业TPT 起效质量浓度为8.31 μg·mL-1，A～E 企业和H 组的TPT 起效质量浓度均为4.16 μg·mL-1）。受试物对CD86 的影响与其对NO 水平的影响趋势基本相符。TP、雷公藤红素和雷公藤对醌B 分别在质量浓度分别为5000、10 000、20 000 ng·mL-1时可抑制LPS 诱导的CD86增加，且变化差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001，图6）。其他单体成分在当前给药浓度范围内未能抑制对LPS诱导的CD86表达量升高。表明现行质量标准中含量测定项WA 单体并无明显免疫抑制活性作用，活性较强的成分为TP、雷公藤红素及雷公藤对醌B。

图5 不同企业TPT对CD86表达水平的影响（,n=6）

图6 TPT主要单体成分对CD86表达水平影响（,n=6）

4 讨论

炎症反应是机体对外源性或内源性刺激的一种防御性反应，参与关节炎、肾损伤、自身免疫疾病等多种病理过程。其中NO 是炎症级联反应中的关键关节，抑制其过度表达，可有效缓解炎症症状[8]。本研究所用的RAW264.7 细胞经LPS、γ-干扰素（IFN-γ）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）激活后转化为M1型巨噬细胞，后者可产生一系列炎症反应，包括分泌大量白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF）、IL-12、IL-18，CD80、CD86共刺激因子呈高表达，以及激活诱导型一氧化氮合酶（NOS2或iNOS）产生NO。

研究结果发现，TP、雷公藤红素和雷公藤对醌B 均对RAW264.7 细胞的活力有一定影响，抑制LPS 诱导的NO 和CD86 水平增加，提示三者为雷公藤多苷片中主要抗炎成分。TP 可抑制TNF-α刺激引起的环氧化酶-2（COX-2）和iNOS 的表达，并诱导前列腺素E2（PGE2）和NO 大量合成[9]。TP 在低浓度作用下可通过调控半胱天冬酶活性来抑制类风湿化膜细胞活性[10]，从而减少滑膜成纤维的过度增生，发挥治疗类风湿性关节炎的作用。雷公藤红素也参与多种炎症信号通路的调控，如阻断细胞核因子κB抑制物激活酶（IκB）的活性，抑制NF-κB 的活化及其核转位，调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等[11]。关于雷公藤对醌B 的药效作用的报道较少，Takaishi 等[12]研究发现雷公藤对醌B 是IL-1 抑制剂，有抗炎和调节免疫的作用，但具体的作用通路尚不明确，本结果与文献报道基本一致，进一步验证了雷公藤对醌B 的体外抗炎作用。值得注意的是，当前TPT的质量控制成分WA未表现出抗炎作用。

通过比较不同企业TPT 发现，所有TPT 均可拮抗LPS 诱导的炎症效应。TPT 中TP 含量为影响RAW264.7 细胞活力，并拮抗LPS 诱导的NO 和CD86 水平升高的主要因素之一。但TP 含量最低的C 企业TPT 也可在较低浓度对上述炎症指标产生抑制作用，各企业TPT的抗炎作用与的TP含量并不完全呈正相关，因此，提示雷公藤红素、雷公藤对醌B 等其他单体成分均与TPT 的药效相关。因此提示，仍需进一步加强对TPT 中雷公藤对醌B、雷公藤红素等主要单体成分的药效学研究，明确TPT 中各成分的含量与其药效的内在联系，才能更加合理科学地规范该制剂的产品质量，保证临床用药的有效性、安全性。