鲜地黄低聚糖纯化及其理化特性和抗氧化活性研究

钱艳艳，王 丽*，文春南，周 艳，李 晓，张丽先，周贤宇，麻兵继*

1河南农业大学农学院中药材系；2河南省生物技术开发中心，郑州 450002

地黄为玄参科地黄属植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的块根，为常用中药材，通常以三种形式(鲜地黄、生地黄、熟地黄)入药[1]。地黄的新鲜块根称鲜地黄[2]，鲜地黄性寒、味甘苦，具有降血糖、补肝肾等功效，历代医学对其特殊功效均有论述，且早已被临床证实[3]。鲜地黄在河南民间有鲜食的习俗，如凉拌、烹炒[4]。地黄中的糖类化合物占地黄较大比例，其低聚糖是继苷类、多糖之后发现的又一类活性组分，已知地黄低聚糖具有补血、降血糖等药理活性，是地黄的有效成分[1]。鲜地黄由于不易保存且运输不便，致使其开发应用受到一定的限制，目前的研究多集中在生地和熟地上，对鲜地黄系统的研究相对较少，Jia等[5]研究结果表明鲜地黄中水苏糖含量为26.45%，明显高于生地黄(9.16%)和熟地黄(5.98%)，具有潜在的研究价值。本实验以鲜地冻干片为原料，利用超声法和热水法同时制备低聚糖，经进一步纯化处理，最终获得两组低聚糖片段(GRCP和GRSP)，并对二者的理化特性及抗氧化能力进行系统全面的分析，旨在为鲜地黄的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

怀地黄采自河南省焦作市温县，品种为85-5。硫酸(天津市科密欧化学试剂开发中心)；无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)；福林酚试剂、考马斯亮蓝(北京博奥拓达科技有限公司)；以上试剂均为分析纯；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)购自东京化成工业株式会社。

1.2 主要仪器

RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；JW-1032低速离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；YU-1810型号紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；Discovery DV215CD型号精密电子天平(美国奥豪斯公司)；SK2200H超声波仪(上海科导超声仪器有限公司)；LGJ-10真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；BioTek Epoch全波长酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取纯化

将鲜地黄洗净沥干，切薄片，放入-24 ℃冰箱中预冷冻之后，置于冷冻干燥机中冷冻干燥40 h，打粉备用。超声法：称取5 g地黄冻干粉，按料液比1∶20(g:mL)加入蒸馏水，在提前升温至60 ℃的超声仪中以100%的功率(即200 W)超声提取10 min，停顿5 min，重复3次为一次提取，过程中不时搅拌，提取两次，合并提取液[6]。热水法：称取5 g地黄冻干粉，按液料比1∶20加入蒸馏水，利用磁力搅拌器进行提取，提取时间为4 h，温度为80 ℃，提取两次，合并提取液。提取液适当浓缩后，采用80%乙醇醇沉，Sevag法脱蛋白，大孔树脂HP-20脱色等处理后冻干，即得到两种低聚糖。低聚糖溶液经DEAE纤维素阴离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶柱层析纯化，最终获得超声提鲜地低聚糖(GRCP)与热水提鲜地低聚糖(GRSP)。

1.3.2 化学成分含量测定

以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定GRCP与GRSP中碳水化合物含量；以葡萄糖醛酸为标准品，采用间羟基联苯法测定酸性糖含量；以牛血清蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[7]。

1.3.3 糖分析与甲基化

采用Agilent 1260高效液相色谱仪(HPLC)进行三种低聚糖含量测定，样品浓度为5 mg/mL，色谱柱：Agilent ZORBOX NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈∶水(7∶3)；进样量10 μL，流速为1.0 mL/min，柱温箱温度为40 ℃。示差折光检测器(RID)检测，检测池温度50 ℃。采用外标一点法进行分析。

采用配备电化学检测器与DionexTMCarboPacTMPA20柱子的ICS5000型号离子色谱系统(Thermo Fisher Scientific)测定GRCP与GRSP的单糖组成[8]。样品甲基化结果采用气质联用仪(GC/MS)进行分析[9]。

1.3.4 光谱扫描

分别取纯品适量，加水溶解，配制成浓度为0.5 mg/mL的溶液，使用紫外可见分光光度仪在190～600 nm范围内扫描，扫描间隔为2 nm，得到GRCP与GRSP的紫外扫描图谱。取干燥的样品适量，与溴化钾研磨压片，采用Bruker-Vector 22型号红外光谱仪进行红外光谱扫描，扫描波数为4 000～400 cm-1[10]。

1.3.5 扫描电子显微镜(SEM)分析

GRCP与GRSP在真空溅射镀膜机中镀上金膜后，使用美国FEI公司的Quanta 250型号扫描电子显微镜对其进行扫描电镜分析，加速电压为5 kV[11]。

1.3.6 热分析

热稳定性的检测使用的热重量分析仪型号为NETZSCH STA 409 PC/PG。使用约5 mg的样品，在氩气(Ar)的保护下进行分析，温度从30 ℃上升到730 ℃，加热速度为10.0 K/min。

1.3.7 质谱分析

质谱分析采用电喷雾质谱(ESI)，正离子和负离子模式全扫描，质量扫描范围为m/z100～1 200。仪器型号为ama Zon ETD。

1.3.8 体外抗氧化能力测定

以Wang等[12]方法为基础并稍做修改，进行样品对体外DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除活性测定。

2 结果与分析

2.1 纯化及化学分析

通过超声法和热水法获得的两组粗糖，得率分别为50.79%和68.27%。由图1A、图1C可以看到超声提鲜地粗糖和热水提鲜地粗糖经过阴离子交换柱层析洗脱后，均可得3个峰，其中水洗脱组分得率最高，明显高于另外两个NaCl洗脱组分，表明粗糖中的主要组分均为水洗脱组分，分别命名为RCP和RSP。由图1B、图1D可以看到RCP和RSP经Sephadex G-50柱洗脱后均得到单一对称峰，说明经DEAE-52纤维素分离已经得到较高纯度的低聚糖或是结构相似的低聚糖[13]。GRCP和GRSP中的化学成分检测结果见表1，二者碳水化合物含量分别是901.39±0.73和948.06±5.03 mg/g，糖醛酸含量分别为53.19±1.37和58.83±0.42 mg/g，可初步判断二者均为中性糖。GRCP和GRSP的总蛋白含量未检出，表明本实验采用的脱蛋白方法较合理。

表1 GRCP和GRSP糖类组成 Table 1 Composition of GRCP and GRSP carbohydrate composition

图1 DEAE-52和Sephadex G-50柱层析结果Fig.1 Results of DEAE-52 and Sephadex G-50 columns

2.2 理化特性分析

2.2.1 糖分析及甲基化分析

采用高效液相色谱法直接测定GRCP和GRSP中蔗糖、棉子糖和水苏糖含量，标品出峰位置为：蔗糖:6.87 min，棉子糖：10.15 min，水苏糖：15.80 min，GRCP和GRSP溶液在标品位置上有相应的峰存在。蔗糖、棉子糖和水苏糖在GRCP和GRSP中总占比分别为85.06%和86.55%，水苏糖在GRCP和GRSP中的相对含量分别是79.73%和80.99%，表明GRCP和GRSP中主要成分是低聚糖，且以水苏糖为主。GRCP和GRSP均由8种单糖组成，均为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸。GRCP中这8种单糖的质量百分比为0.08∶51.40∶43.25∶0.57∶0.12∶4.23∶0.17∶0.17。GRSP中这8种单糖的质量百分比为0.08∶51.56∶43.80∶0.46∶0.10∶3.74∶0.14∶0.11 。单糖的质量百分比比值结果显示GRCP和GRSP主要由半乳糖、葡萄糖组成，其次是果糖，表明二者可能具有相似的碳链骨架。半乳糖醛酸与葡萄糖醛酸在GRCP和GRSP中的总质量百分比分别为0.32%、0.23%，此结果与糖醛酸含量测定结果一致，表明GRCP和GRSP均属于中性糖。低聚糖主要为水苏糖，是由2分子α-半乳糖、1分子α-葡萄糖和1分子β-果糖构成的四糖。蔗糖是由1分子β-果糖、1分子α-葡萄糖构成的二糖；棉子糖是由1分子α-半乳糖、1分子α-葡萄糖、1分子β-果糖构成的三糖。以此推测，果糖和葡萄糖的质量百分比应该相接近，单糖组成果糖含量远低于葡萄糖，其原因可能是由于大量果糖转化成葡萄糖，其确切的原因有待进一步研究。

由甲基化结果总离子流图(见图2)显示，GRCP和GRSP主要甲基化样品出峰时间相差不多，三个主峰的出峰时间均为13.8、16.9和17.9 min左右，对应糖残基分别是T-Glcp、1,6-Glcp、1,6-Galp，表明GRCP和GRSP的糖链主要以1→6连接的葡萄糖(分别占46.17%和49.32%)和半乳糖(分别占48.71%和46.50%)组成，端基主要是葡萄糖(分别占5.12%和4.18%)[14]。

图2 GRCP(A)和GRSP(B)的甲基化总离子流图Fig.2 Total ion flow diagrams of methylation of GRCP (A) and GRSP (B)

2.2.2 光谱分析

紫外扫描结果显示，GRCP和GRSP均在约190 nm波长处有单一尖锐的大峰，表明样品纯度较高。二者在254 nm波长处均有小峰，GRSP在298 nm波长处有小峰，表明可能含有少量杂质。二者峰形相似，但紫外吸收值不同，说明不同提取方法制备得到的两组片段，其含量存在差异。红外光谱分析的目的是鉴别GRCP和GRSP中的主要官能团，如图3B所示，二者FT-IR光谱相似，说明其含有相似官能团。光谱在3 400 cm-1附近由于O-H键的伸缩振动出现了强而宽的吸收峰，表明样品中存在分子内氢键或分子间氢键[15]。在2 925 cm-1处的一个小峰是由次甲基中C-H键的伸缩振动引起的。1 644 cm-1处的峰常被认为是来自结晶水中O-H键的伸缩振动。FT-IR光谱在1 560 cm-1处不存在特征带，与提取的糖中蛋白质含量极低相一致。在1 419、1 417和1 350 cm-1处的峰值与C-H键的折叠有关。在1 200～1 000 cm-1处较大的吸收峰是糖类化合物C-O的伸缩振动，与糖苷键的伸缩振动有关，其中1 143 cm-1为C-O-H的伸缩振动，1 050 cm-1为C-O-C的伸缩振动[16]。

图3 GRCP和GRSP紫外光谱(A)和红外光谱(B)分析图Fig.3 Ultraviolet (A) and infrared (B) spectra of GRCP and GRSP

2.2.3 扫描电子显微镜(SEM)

由图4中不同放大倍数下的地黄低聚糖SEM图片可以看出，GRCP和GRSP的结构有明显不同。在×500、50 μm的放大条件下可以明显看出GRCP呈片状，且为大小不一的无规则碎片，含有较多不规则碎片状颗粒，断面尖锐；GRSP表面平滑且线条流畅[17]。在×2 000，20 μm的放大条件下可以看出GRCP含有表面凹凸不平的粗棒状结构，也有较细的光滑棒状结构，GRSP有直径5～10 μm的光滑结节。原因可能是水提法较温和，而超声法由于超声空化作用，对糖类结构破坏较大，使其原本光滑的表面变得粗糙[18]。

图4 GRCP(A)和GRSP(B)的SEM照片图像Fig.4 Scanning electron micrographs of GRCP (A) and GRSP (B)注：图像1的放大条件为5 kV，×500，100 μm；图像2的放大条件为5 kV，×2 000，20 μm；图像3的放大条件为5 kV，×1 000，50 μm；图像4的放大条件为5 kV，×2 000，20 μm。Note:The magnifying condition of image 1 was 5 kV,×500,100 μm;The magnifying condition of image 2 was 5 kV,×2 000,20 μm;The magnifying condition of image 3 was 5 kV,×1 000,50 μm;The magnifying condition of image 4 was 5 kV ×2 000,20 μm.

2.2.4 热分析

由图5可知GRCP与GRSP的热分解均分为两个阶段。第一阶段为30.0～205.5 ℃和30.0～209.0 ℃，GRCP与GRSP在此过程中的质量损失分别约为7.79%和6.77%，此过程主要与样品中结合水的损失有关。第二阶段的分解，可能是由于有机物的解聚。在205.5 ℃至700 ℃之间，GRCP的质量下降了约69.69%，在209.0 ℃至700.0 ℃之间，GRSP的质量下降了约72.49%。在第一阶段GRCP质量减少较多，第二阶段则是GRSP质量减少较多。GRCP与GRSP的初始分解温度分别为205.5、209.0 ℃，两个组分的分解速率分别在217.4、222.5 ℃时达到最大，二者裂解峰尖锐且对称，表明成分单一，纯度较高。TG和DSC结果表明，GRCP与GRSP结构分别在205.5、209.0 ℃下相对稳定，表明二者热稳定性好。

图5 GRCP和GRSP的热分解曲线Fig.5 Thermal decomposition curves of GRCP and GRSP

2.2.5 质谱分析

利用ESI质谱对GRCP和GRSP主成分进行分析(荷质比均四舍五入为整值进行计算)，选择质谱中最显著的分子离子峰进行分析[19]。在正离子模式下，GRCP和GRSP表现出突出的三组分子离子峰信号：m/z365和527(对应分子离子[M+Na]+)提示两种化合物相对分子质量为342和504；m/z689和705提示存在相对分子质量为666的一种化合物(分别对应分子离子[M+Na]+和[M+K]+)。在负离子模式下，m/z341和377提示存在相对分子质量为342的一种化合物(分别对应分子离子为[M-H]-、[M+35Cl]-)；同样，m/z503、539和m/z665、701分别提示存在相对分子质量为504和666的两种化合物。而相对分子质量为342、504、666的化合物，对应的物质分别是蔗糖、棉子糖和水苏糖[20]。GRCP和GRSP的正离子质谱图中的m/z689、705与负离子质谱图中的m/z665、701丰度明显高于其他峰，表明GRCP和GRSP的主要成分为水苏糖，而棉子糖含量则远低于水苏糖含量。

2.3 抗氧化活性

利用GRCP和GRSP清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基能力评价其体外抗氧化活性，结果(见图6)在样品浓度为0.5～7.0 mg/mL时，GRSP清除DPPH自由基能力强于GRCP，浓度为7.0～9.0 mg/mL时，GRCP强于GRSP，在10 mg/mL时二者清除DPPH自由基能力几乎相同。在样品浓度为0.5～10.0 mg/mL范围内，GRCP清除超氧阴离子自由基能力强于GRSP，至10 mg/mL时，二者的清除能力均达到60%。随着样品浓度由0.5 mg/mL增加到10 mg/mL，GRCP和GRSP清除DPPH自由基能力分别提高了约15%和10%，二者清除超氧阴离子自由基能力分别提高了约15%和30%。综上所述，GRCP和GRSP对DPPH自由基和超氧阴离子自由基均表现出一定的清除作用，可作为潜在的抗氧化剂。

图6 GRCP和GRSP的抗氧化能力Fig.6 The radical scavenging activities of GRCP and GRSP

3 讨论

以鲜地黄冻干片为原料，利用超声法和热水法对其所含低聚糖进行提取纯化处理，最终得到GRCP和GRSP两组片段。二者的碳水化合物含量分别是901.39和948.06 mg/g，二者杂质少、纯度高，表明纯化比较成功，且远远高于前人提取的糖类中水苏糖占比为26.45%的结论[21]。本实验对鲜地黄中水苏糖的提取纯化及理化性质进行全面研究，结果表明，GRCP和GRSP中的主要官能团相同，主要成分均为低聚糖，以水苏糖为主，热分析结果表明其结构分别在205.5、209.0 ℃以下较为稳定。两组片段的单糖组成种类一致，但比例不同，SEM观察表明其外观形貌具有一定的差异，表明不同提取方法对低聚糖结构具有一定的影响。活性测定结果表明两组片段有一定的抗氧化活性。质谱结果同样表明GRCP和GRSP的主要成分是水苏糖，水苏糖是一种功能性低聚糖，由2分子α-半乳糖、1分子α-葡萄糖和1分子β-果糖构成的四糖，具有调节肠道菌群平衡、调节免疫等功效，是一种优质的功能性食品配料。低聚糖为2～10个单糖通过糖苷键连接而成的低聚糖，常用低聚糖提取方法为水提醇沉法，用体积分数为80%的乙醇沉淀以去除多糖，降低多糖的干扰，有利于进一步纯化[22]。Wu[23]采用75%乙醇提取鲜地黄低聚糖，取上清液进行后续提取。同时，体积分数为80%左右的乙醇常被用于沉淀以获得多糖。如Wang等[12]研究发现可分别采用体积分数为30%、60%、80%的乙醇沉淀获得不同分子量的多糖以得到平菇多糖。Yang等[24]采用80%的乙醇沉淀多糖并对其进行纯化，最终分别得到桦褐孔菌多糖和红枣多糖。Ye等[6]从提取液的90%乙醇沉淀中得到白花蛇舌草多糖等。本实验加入四倍于提取液体积的无水乙醇(最终浓度为80%)进行醇沉，取沉淀继续纯化，最终纯化物的主要成分是水苏糖，表明80%的乙醇沉淀中存在低聚糖，并不都是多糖。产生这一结果的原因可能是水苏糖以被包裹的形式，大量被80%乙醇所沉淀，或者是水苏糖在80%的乙醇中溶解度有限，可部分沉淀。然而，具体的原因还有待进一步研究。预实验中将醇沉物用3 500 Da透析袋透析发现，3 500 Da透析袋内的糖类物质得率只有0.61%，也表明醇沉物中绝大部分物质分子量较小。所以后期采用500～1 000 Da的透析袋将纯化物与其他小分子物质及杂质分离开，这是提高样品纯度的一种简便好用的方法。本研究为鲜地黄低聚糖尤其是水苏糖资源的系统研究和进一步合理开发利用提供理论依据。