生地黄标准汤剂质量评价及其指纹图谱的建立*

杨巧虹，陈萍

(1.重庆医疗器械质量检验中心，重庆 401147；2.陕西省中医药研究院，西安 710003)

生地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥块根，味甘，性寒，归心、肝、肾经，具有清热凉血、养阴生津的功效[1]。地黄分布广泛，主产于河南、山西、河北、山东等地，为四大怀药之一[2]。生地黄主要含有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、糖类、氨基酸类等化合物[3]。药理研究表明，生地黄具有止血、强心、降血糖、抗炎、提高免疫力、利尿、保肝等作用[4-5]，临床常用于治疗肾阴不足、瘀血阻滞而引起的各种出血症[6]。

标准汤剂作为一种标准物质和标准体系，既有投料饮片的代表性，又有传统制法和制备工艺的一致性，还有临床疗效和质量的稳定性，为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的参照物的标准[7]。关于生地黄标准汤剂的质量标准及指纹图谱研究笔者尚未见文献报道。笔者在本研究中收集到合格的生地黄饮片15批作为原料，依据《医疗机构中药煎药室管理规范》[8]，制备生地黄饮片标准汤剂，对其中苯乙醇苷类成分进行含量测定，并建立特征图谱，为生地黄标准汤剂作为衡量配方颗粒与临床汤剂的一致性提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CP2102型百分之一天平(奥豪斯仪器<常州>有限公司)；SQP型电子天平(赛多利斯科学仪器<北京>有限公司，感量：0.01 mg)；ZDHW型调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(北京科伟永兴仪器有限公司)；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；FZG-1400真空干燥箱(陕西昌泰实业有限公司)；Synergy型超纯水制水机(默瑞<上海>生物科技有限公司)。

1.2试剂与试药

1.2.1试剂 乙腈(OCEANOAK公司，批号：30281-27409，色谱级)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170110，色谱级)；甲醇(天津市天力化学试剂有限公司，批号：20200608，分析纯)；水为自制超纯水。

1.2.2试药 毛蕊花糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：1530-200202，含量>98.0%)；焦地黄苯乙醇苷A1对照品(批号：P16M11S109726，含量>95.0%)、焦地黄苯乙醇苷B1对照品(批号：P16M11S109727，含量>97.0%)、异毛蕊花糖苷对照品(批号：W17J10C90785，含量>98.0%)，均购于上海源叶生物科技有限公司。18批生地黄饮片，经陕西省中医药研究院杨智峰研究员鉴定为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥块根，见表1。

表1 生地黄饮片来源信息表

2 方法与结果

2.1生地黄饮片质量考察 依据《中华人民共和国药典》(2015年版一部)生地黄饮片项下的性状、鉴别(显微鉴别、薄层色谱鉴别)、检查(水分、总灰分、酸不溶性灰分)、浸出物及含量测定检查方法，对18批生地黄饮片进行质量考察，结果15批饮片的性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定结果均符合2015年版《中华人民共和国药典》要求，15批样品均检出地黄显微特征。结果见图1—图3与表2。

1.木栓细胞；2.分泌细胞；3.薄壁细胞；4.核状物；5.导管；6.草酸钙方晶。

1.毛蕊花糖苷；2.生地黄对照药材；3～17.1～15号生地黄药材；18.生地黄对照药材；19.毛蕊花糖苷。

1.梓醇；2.生地黄对照药材；3-10.1-8号生地黄药材；11.梓醇；12.生地黄对照药材；13-19.9-15号生地黄药材。

2.2生地黄饮片标准汤剂制备 依据国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》原则，称取15批质量合格的生地黄饮片各50 g，分别加8倍量的水，浸泡1 h，加热回流提取0.5 h，趁热滤过，分离出煎煮液后，药渣加8倍量的水回流提取0.5 h，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至250 mL，即得1～15号生地黄标准汤剂，备用。

2.3生地黄饮片标准汤剂薄层色谱鉴别 取生地黄饮片标准汤剂5 mL，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取水5 mL，按照供试品溶液制备方法制备成阴性对照溶液。吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液各5 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16：0.5：2)为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1%的2，2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液浸板，晾干。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见图4。

1.毛蕊花糖苷；2-16.1-15号生地黄药材；17.毛蕊花糖苷。

表2 15批生地黄饮片质量考察结果

取生地黄饮片标准汤剂10 mL，加甲醇20 mL，超声10 min，滤过，滤液浓缩至5 mL，作为供试品溶液。取梓醇对照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。取水10 mL，按照上述溶液制备方法制备成阴性对照溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(14：6：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图5。

1.梓醇；2-8.1-7号生地黄标准汤剂；9.阴性；10-19.8-15号生地黄标准汤剂。

2.4生地黄饮片标准汤剂特征成分含量测定[9-13]

2.4.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，洗脱程序见表3；流速：0.8 mL·min-1，检测波长：334 nm，柱温：25 ℃，进样量10 μL，理论板数按特征成分峰计算均不低于5 000。

表3 梯度洗脱程序

2.4.2溶液制备 对照品溶液：取适量的焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷对照品，精密称定，加乙腈-0.1%磷酸溶液(16：84)制成每毫升分别含焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷95.00，108.80，53.00，45.36 μg的混合对照品溶液。

供试品溶液：精密量取1～15号生地黄饮片标准汤剂10 mL，置50 mL量瓶中，分别加甲醇30 mL，超声10 min，用甲醇稀释至50 mL，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，蒸干，残渣用乙腈-0.1%磷酸溶液(16：84)溶解，转移至10 mL量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液(16：84)稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液即为供试品溶液。

阴性对照溶液：精密吸取水10 mL，按上述溶液制备方法制备，即得阴性对照溶液。

2.4.3专属性实验 精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 μL，采用“2.4.1”项下色谱条件进样测定。焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷的保留时间分别为34.611，45.044，48.525，52.131 min，分离度均>1.5，理论板数均>6 000，拖尾因子为1.03～1.31。阴性对照溶液色谱在相同保留时间处无干扰峰出现，表明专属性良好。见图6。

1.焦地黄苯乙醇苷A1；2.毛蕊花糖苷；3.焦地黄苯乙醇苷B1；4.异毛蕊花糖苷。

2.4.4线性关系考察 精密量取混合对照品溶液0.02，0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL，分别置1 mL量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸溶液(16：84)稀释至刻度，摇匀，制成系列混合对照品溶液，精密吸取10 μL，以“2.4.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，以质量浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，线性回归分析，结果见表4。

表4 4种对照品的回归方程及线性范围

2.4.5精密度实验 取混合对照品溶液和同一批生地黄标准汤剂供试品溶液(批号：20200101)，按“2.4.1”项下色谱条件，连续进样6次。结果对照品溶液焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.72%、0.56%、2.21%、3.47%，供试品溶液焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷峰面积的RSD为4.47%、0.56%、4.21%、3.46%，表明仪器的精密度良好。

2.4.6稳定性实验 取同一供试品溶液(批号：20200101)，按“2.4.1”项下色谱条件，分别在0，2，4，6，8，12，24，36 h时进样分析。结果焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为3.95%、2.76%、4.63%及4.53%，表明供试品溶液在36 h内室温下稳定性良好。

2.4.7重复性实验 取同一批生地黄标准汤剂样品(批号：20200101)10 mL，共6份，按“2.4.2”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定。结果焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷的平均含量分别为31.563 3，28.614 9，11.846 1，13.177 3 μg·mL-1，RSD值分别为4.08%、1.57%、4.57%及4.85%，表明该方法重复性良好。

2.4.8加样回收率实验 取已知含量的同一批生地黄标准汤剂(批号：20200101)5 mL，共9份，每3份为一组，置50 mL量瓶中，分别精密加入焦地黄苯乙醇苷A1对照品溶液(156.75 μg·mL-1)0.5，1.0及1.5 mL、毛蕊花糖苷对照品溶液(244.80 μg·mL-1)0.3，0.6及0.9 mL，焦地黄苯乙醇苷B1对照品溶液(148.4 μg·mL-1)0.2，0.4及0.6 mL，异毛蕊花糖苷对照品溶液(164.43 μg·mL-1)0.2，0.4及0.6 mL，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，计算。结果见表5。

表5 4种对照品的加样回收率实验结果

2.4.9含量测定 取15批生地黄标准汤剂供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定。结果见表6。

2.5生地黄标准汤剂出膏率及转移率测定

2.5.1出膏率计算 精密量取1～15号标准汤剂各20 mL，分别置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴锅上蒸干，残渣于105 ℃干燥3 h，干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算出膏率。出膏率(%)=m1/20×V/m2×100% (m1为干膏质量、V为样品溶液总体积、m2为饮片质量)。结果见表6。生地黄标准汤剂15批出膏率为54.97%～62.78%，平均值为(58.49±2.83)%。

2.5.2苯乙醇苷类转移率计算 转移率(%)=标准汤剂中特征成分含量/饮片中特征成分含量×100%。结果见表6。15批标准汤剂中苯乙醇苷类成分含量为0.034 9%～0.063 3%，平均值为(0.051±0.009)%，转移率为58.17%～87.95%，平均(76.11±9.53)%。

表6 15批标准汤剂指标成分含量及出膏率、转移率计算结果

2.6高效液相色谱特征指纹图谱建立

2.6.1色谱条件 同“2.4.1”项下的色谱条件。

2.6.2溶液制备 采用“2.4.2”项下的混合对照品溶液和15批供试品溶液。

2.6.3方法学考察 精密度实验：取同一批生地黄标准汤剂供试品溶液(批号：20200101)，按照“2.4.1”项下色谱条件进样，连续6次。2号色谱峰(毛蕊花糖苷)在生地黄标准汤剂的制备过程中相对较稳定、含量高、分离度好，故被选作参照峰。以毛蕊花糖苷为参照，计算，共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于5% (n=6)，表明方法精密度良好。

稳定性实验：精密吸取生地黄标准汤剂供试品溶液(批号：20200101)适量，分别于0，2，4，8，12，16，24 h时，按“2.4.1”项下色谱条件进样。以毛蕊花糖苷为参照，计算，共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于5%(n=7)，表明供试品溶液在室温中24 h内较为稳定[11]。

重复性实验：精密量取生地黄标准汤剂适量，按“2.4.2”项下供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定。以毛蕊花糖苷为参照，计算，共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于5%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.6.4指纹图谱建立 取15批供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定。经分析，供试品溶液的液相色谱图中2号峰毛蕊花糖苷峰面积最大且稳定，分离度好，保留时间居中，易于辨认，故选为本品指纹图谱参照峰，见图7。

1.焦地黄苯乙醇苷A1；2.毛蕊花糖苷；3.焦地黄苯乙醇苷B1；4.异毛蕊花糖苷。

将15批供试品溶液液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，参照图谱设为S1，对照图谱生成方法设为平均数，时间窗宽度设为0.10，多点校正，自动匹配，生成对照图谱，分别计算相似度[11]，并以2号毛蕊花糖苷为参照物，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表7、表8。图8为15批生地黄标准汤剂的特征指纹图谱。由图表可见，15批生地黄标准汤剂与对照指纹图谱相似度均>0.96(表9)。表明一致性良好。

表7 15批生地黄标准汤剂共有峰相对保留时间

表8 15批生地黄标准汤剂共有峰相对峰面积

表9 15批生地黄标准汤剂指纹图谱相似度评价表

图8 生地黄标准汤剂高效液相指纹图谱

3 讨论

3.1色谱条件的选择 本实验对地黄标准汤剂中4个苯乙醇苷类成分进行考察，在预实验中对波长、流动相进行考察。波长选择参考《中华人民共和国药典》2015年一部地黄项下毛蕊花糖苷含量测定选用的检测波长334 nm；比较乙腈-0.1%醋酸溶液与乙腈-0.1%磷酸溶液两种流动相，发现选择乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相时基线更平稳，峰形较好，特征成分分离效果好。

3.2定性鉴别成分筛选 参照《中华人民共和国药典》2015年一部和2020年一部中地黄药材项下选用梓醇与毛蕊花糖苷两个指标成分作为薄层鉴别，且两种指标成分也作为含量测定，但地黄苷D成分未见相关研究用于薄层鉴别，故选用这两种成分作为薄层鉴别指标成分。

3.3特征成分筛选 由于毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷属于同分异构体，饮片在煎煮过程中毛蕊花糖苷可能会部分转化为异毛蕊花糖苷[14-16]，实验以4种苯乙醇苷类(焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1和异毛蕊花糖苷)总量来表征提取物的含量，可以达到质量均一性，生地黄标准汤剂中焦地黄苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1及异毛蕊花糖苷提取率高、转移率稳定，故采用4个成分共同作为质量评价的定量特征成分。

3.4标准汤剂pH、密度的测量 实验测定了15批生地黄标准汤剂的pH值均为4.5、密度范围为1.042～1.054，可以作为质量控制的指标之一。

3.5量值传递与质量评价 经过研究从投料饮片到标准汤剂质量控制，再到标准汤剂指纹图谱3个方面进行研究，建立生地黄标准汤剂的苯乙醇苷类含量测定方法和特征指纹图谱，实现对生地黄标准汤剂的质量评价。结果表明，15批生地黄标准汤剂的平均出膏率为(58.49±2.83)%，苯乙醇苷类成分平均含量为(0.051±0.009)%；按研究建立的15批生地黄标准汤剂各参数均值的75%～125%计，其参数范围确定为：出膏率43.86%～73.11%，苯乙醇苷类含量0.037%～0.063%，平均出膏率、苯乙醇苷类平均含量均在参数范围内，表明生地黄标准汤剂质量均一性较好。