食管癌癌前病变的临床分子检测研究进展

许镒洧，林逸伟，彭裕辉，李荣耀，李恩民

2018年全球最新癌症统计数据表明，在全球恶性肿瘤发病率和致死率中，食管癌(esophageal cancer,EC)分别位于第七位和第六位[1]。我国是食管癌高发区，发病率居全球前五[1]，且大部分食管癌患者入院检查时已处于中晚期，5 a生存率仅30.3%[2]，死亡率居高不下[3]，防治形势十分严峻。

食管癌癌前病变(precancerous lesions,PL)，是指已证实与食管癌发生密切相关的病理变化，食管鳞癌的癌前病变主要指食管鳞状上皮异型增生，WHO现称为上皮内瘤变(intraepithelial neoplasia,IN)，其可根据细胞异型增生的程度和上皮累及的深度分为低级别IN (low grade IN，LGIN)和高级别IN(high grade IN，HGIN)。LGIN相当于轻、中度异型增生，异型细胞局限在上皮下1/2以内；HGIN相当于重度异型增生及原位癌，异型细胞累及上皮下1/2及以上。 Barrett食管异型增生则是食管腺癌的癌前病变。Barrett食管(Barrett’s esophagus,BE)是指食管下段的复层鳞状上皮被化生的单层柱状上皮所替代的一种病理现象，可伴或不伴肠化生，其中伴有肠化生的属于食管腺癌的癌前病变，不伴有肠化生的是否属于癌前病变，目前仍有争议[4-7]。异型增生与既往使用的术语IN为同义词,处理原则相同[5]。

目前，临床上对于食管癌癌前病变的检测，主要是通过内窥镜染色技术，同时结合活检组织病理学探查[8]。迄今，尚没有特异分子标志物在临床上应用。但近年来，关于食管癌癌前病变生物标志物的研究日趋增多，主要包括外周血或组织中有关蛋白、自身抗体、基因(或甲基化)和microRNA等，其潜在的诊断意义也越来越受到重视。

1 组织分子标志物

1.1 组织蛋白分子标志物福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded，FFPE)是普遍采用的组织保存方法，可长时间保存组织，反复利用。免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)是目前广泛应用的一种组织蛋白分子检测技术，可用于检测肿瘤组织中某种蛋白的定位/半定量表达，对鉴别肿瘤分子标志物有重要临床意义。到目前为止，已有多项研究支持检测组织蛋白表达对于鉴别食管癌癌前病变的临床指导意义。人抑癌基因P53位于17号染色体短臂，该基因编码的p53蛋白在细胞增殖的调控中发挥重要的作用。在许多恶性肿瘤中，存在着P53基因的突变和/或缺失，导致p53蛋白半衰期延长并在细胞核中积累[9]。王立东等[10]用IHC检测方法，在手术切除癌旁组织中的14例正常黏膜、18例基底细胞过度增生、12例IN以及10例原位癌组织标本中，发现p53蛋白异常表达的阳性率分别为0%、78%、92%和80%，而在6例正常黏膜、40例基底细胞过度增生、5例IN的活检组织标本中分别为50%、97%和100%。这些结果表明在食管癌的病变过程中，p53蛋白在细胞，尤其是细胞核中的积累较早发生，可能是一种识别食管癌高危人群的早期分子标志物。另外，Kaye PV等[11]应用IHC检测p53蛋白，发现其在食管腺癌癌前病变，尤其是低级别异型增生的诊断中可发挥辅助作用。虽然p53蛋白尚未被批准用于临床检测，但有成为诊断食管癌癌前病变分子标志物的潜力。再者，微小染色体维持蛋白2(minichrosome maintenance protein 2，MCM2)属于MCM蛋白家族，由CDC基因编码，只存在于处于细胞周期的细胞核中，当细胞进入G0期和分化衰老阶段时，MCMs水平下降甚至不能被检测出来。因此，在增殖发育异常的细胞中，MCM2可作为细胞增殖的分子标记物，提示细胞所处的状态，且与组织癌前病变程度相关[12]。Sirieix PS等[13]在BE与正常组织样本的回顾性研究中确定，MCM2蛋白的灵敏度和特异性分别为62.9%和100%，表明MCM2蛋白是BE的潜在分子标志物。还有，三叶因子3(trefoil factor 3，TFF3)为三叶因子多肽家族成员，是一种黏液相关肽，具有多种生物学功能，包括通过细胞迁移进行黏膜修复、调控干细胞分化、与黏液的相互作用、调节黏膜免疫应答等。TFF3与肿瘤的发生发展密切相关，可促进肿瘤的侵袭、转移与血管生成[14]。Lao SP等[14]利用46例BE组织和99例对照组织样本检测TFF3，其中36例BE和6例对照组织样本显示TFF3阳性，其灵敏度和特异度分别为78%和94%，提示其可能作为检测BE的分子标志物。其他潜在的分子标志物，如PFN2、IMP3和COX2等，对于食管癌癌前病变均有良好的诊断效能(表1)，表明检测相关组织蛋白对于食管癌癌前病变的鉴别诊断有潜在的临床意义。

表1 食管癌癌前病变相关组织分子标志物[10,13-30]

1.2 组织MicroRNA标志物MicroRNAs(miRNAs)是一类在序列上高度保守的内源性非编码单链小RNA分子，长约19～25个核苷酸，在转录后水平发挥调控作用，参与细胞增殖、分化、凋亡等生理病理过程。研究表明，miRNAs是潜在的肿瘤诊断分子标志物，可用于食管癌癌前病变的诊断[31-32]。在一项对BE的研究中，Li XD等不仅证实了检测病变组织miR-192、miR-194、miR-196a、miR-215拥有潜在的诊断能力(AUC>0.80)，还发现将这些miRNA组合在一起能进一步提高BE诊断的准确性，其敏感性、特异性和AUC分别提高到83.9%～93.1%、90.5%～93.7%和0.87～0.93，显著提高了诊断效能[25]。

1.3 基因异常甲基化标志物基因甲基化通常发生在DNA分子CpG二核苷酸位点，是哺乳动物基因组的一种表观遗传学修饰。基因异常甲基化，特别是抑癌基因的异常甲基化，常在食管癌癌前病变阶段就已经发生，具有诊断食管癌癌前病变的潜能[33]。在食管癌癌前病变中，HIN-1、P16/CDKN2A和RARβ2等基因的甲基化具有极高的特异性。在Schulmann K等[28]对BE的研究中，也表明了基因的甲基化对于BE检测有良好的诊断效能，包括APC和3-OST-2等基因。

2 外周血分子标志物

2.1 外周血蛋白分子标志物外周血检测是一种非侵入性的检测手段，在癌症诊断中具有广泛的应用前景。既往研究发现了多种与肿瘤发生发展相关的外周血蛋白分子标志物[34]。Zhou SL等[35]鉴定了一个自身抗体组合，对于检测食管癌IN的敏感性为38%，特异性为94%。Zhai Xh等[36]利用185例ESCC和癌前病变组织样本，通过SELDI-TOF-MS和SVM方法，筛选出了两组标志物，其中检测DYS组的标志物组合，包括2944、13768、13978和28061等质谱峰，其敏感性和特异性分别为84.7%和90.6%，而另一组标志物9304、7781和8159等质谱峰，对于检测食管基底细胞过度增生(basal cell hyperplasia，BCH)的敏感性和特异性分别为59.5%和96.3%。这些研究均显示了外周血蛋白分子标志物用于检测食管癌癌前病变的潜力。见表2。

表2 食管癌癌前病变相关外周血分子标志物[35-42]

2.2 外周血miRNA标志物血清miRNA非常稳定，重复性好，可以抵抗RNA酶的消化和苛刻的外部环境，如反复冻融、长时间室温放置、过酸过碱或极端pH等。外周血miRNA是潜在的非侵入性分子标志物，可用于食管癌癌前病变的诊断[32,43]。Shen Y等通过全基因组miRNA表达谱筛选出7个候选miRNA，在96例ESCC、92例食管癌癌前病变和78例正常食管的组织样本中进行验证，发现其中4个miRNA的联合检测有良好诊断效能，敏感性和特异性分别为82.6%和80.8%，AUC为0.842[37]。在BE检测方面，Bus P等的研究也证实了外周血miRNA组合诊断的潜能，其敏感性和特异性分别为78.38%和85.71%，AUC=0.832(95%CI：0.698～0.967)[38]。

3 展望

早诊早治既是防治食管癌的重中之重，也是提高患者生存率最为有效的措施。目前临床上对于食管癌癌前病变的检测，主要是通过内窥镜检查结合染色指示剂活检及病理学检查[8]，尚没有特异生物标志物正式应用到临床检测中来。作为理想的生物标志物，不仅应该具有高的敏感性和特异性，还应具有高的阳性预测值和阴性预测值，且能稳定存在于血清或组织中。目前临床上所用标志物主要有鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)等，但由于上述肿瘤标志物大多敏感性或特异性不高，使其在临床上的应用受到极大的限制，并不能有效地指导食管癌癌前病变的临床早期诊治，因而急需对其他潜在生物标志物进行探索研究并进行性能验证。近年来，已有许多研究表明，一些分子标志物对于食管癌癌前病变表现出潜在的临床诊断效能。但总的来说，这些研究仍存在一些问题，例如样本量小、研究设计单一人群、缺乏独立验证试验、缺乏临床前数据等。因此，上述相关标志物仍需多中心、大样本的研究来验证其诊断效能。