蒙药自拟处方泵嘎日-17的质量标准相关性研究

王怀刚 王怀伟 白雅静

1.呼伦贝尔市食品药品检验所，内蒙古 呼伦贝尔 021000； 2.内蒙古自治区扎兰屯市人民医院，内蒙古 扎兰屯 162650

泵嘎日-17为呼伦贝尔市中蒙医院自制制剂，处方由黄柏、麦冬、人工牛黄、熊胆粉、紫花地丁等17味药组成，具有清热解毒的功效，临床适用于急性胆囊炎的治疗，在蒙医医院临床为长期使用的制剂，临床疗效显著[1]。蒙医学认为，胆为希拉之物质基础，具有消化之功能，据希拉之位的腑器，也是病变希拉窜行之道。因此，胆病多由希拉热引起。据《四部医典》记载“当医治肺、肝、胆病时，应以清热邪为主”[2]。方中熊胆具有清热解毒、止痛、明目之功效，临床用于治疗肝热炽盛，热极生风所致的惊风，抽搐。肝热，目赤肿痛， 以及用于疮痈肿痛等症[3]。而黄柏具有清热燥湿、泻火解毒、消肿祛腐的功效。临床用于治疗湿热泻痢、黄疸、带下、热淋、痔漏、盗汗、遗精等症[4]。两味药在本方治疗急性胆囊炎中发挥主药作用。研究采用薄层色谱法和高效液相色谱法对制剂中的熊胆和黄柏进行定性与定量研究，经方法验证确定了理想的实验条件，表明该方法重现性好，专属性强，并且方中其他成分无干扰，对泵嘎日-17的质量控制起到了很好的效果。

1 仪器与材料

1.1 仪器 KQ5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Sartorius BP211D 型电子分析天平；Sartorius BS224S型电子分析天平；202型电热恒温干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)；岛津LC-20AT高效液相色谱仪。

1.2 材料 泵嘎日-17制剂由呼伦贝尔市中蒙医院制剂室提供；盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201212 含量：86.7%)、熊去氧胆酸对照品(批号：110755-201704)、鹅去氧胆酸对照品(批号：110806-201708)和胆酸对照品(批号：100078-201415)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 熊胆的薄层色谱鉴别

2.1.1 对照品溶液的制备 取熊去氧胆酸、胆酸、鹅去氧胆酸对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 样品溶液的制备 取本品粉末1g，加30 mL甲醇，温热使溶解，放冷，过滤，滤液蒸干，加10 mL氢氧化钠溶液(1→ 5)，加热回流1 h，放冷，滴加稀盐酸调节pH值2～3后，乙酸乙酯试剂振摇提取4次，每次10 mL，合并提取液，蒸干，残渣用2 mL甲醇溶解，作为样品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取1g不含熊胆的处方样品，同样品的制备方法制成熊胆阴性对照溶液。

2.1.4 薄层色谱条件及结果 照薄层色谱法[5](《中国药典》2015年版四部通则0502)，吸取供试品溶液2 μL、对照品溶液2 μL、阴性对照品2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷-乙醚-冰醋酸-正丁醇-水(10∶5∶5∶3∶1)的上层溶液展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热约10 min。置紫外光灯365 nm下检视(温度：27 ℃；湿度：32%)。结果样品色谱中，在与熊去氧胆酸、胆酸、鹅去氧胆酸对照品的相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果如图1所示。

图1 泵嘎日-17中熊胆薄层色谱图

2.2 黄柏的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适应性条件 填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(25∶75)，流速为1 mL/min，检测波长为265 nm，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4000。

2.2.2 溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定盐酸小檗碱对照品适量，加盐酸-甲醇(1∶100) 的混合溶液制成每1 mL含50 ug的溶液，即得。

2.2.2.2 样品溶液的制备 精密称定本品细粉约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL盐酸-甲醇(1∶100)的混合溶液，密塞，称定重量，超声处理30 min(功率140 W,频率4 kHz)，放冷，再称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 专属性考察 分别取阴性样品供试溶液(除不加黄柏外其余几份药材按原方配比)、泵嘎日-17供试样品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪。按上述色谱条件进行实验，结果显示，阴性样品对盐酸小檗碱含量测定结果无干扰。结果如图2所示。

A.盐酸小檗碱对照品溶液；B.泵嘎日-17供试样品溶液；C.阴性样品供试溶液图2 专属性考察高效液相色谱图

2.2.4 线性范围 精密称定盐酸小檗碱对照品2.5 mg(实际取2.565 mg)，置10 mL量瓶中，加(盐酸-甲醇 1∶100)使溶解并稀释至刻度，摇匀(相当于0.2565 mg/mL)。精密吸取上述对照品溶液0.5、1、2 mL分别置25 mL量瓶中，吸取2 mL、3 mL分别置10 mL量瓶中，加(盐酸-甲醇1∶100)混合溶液至刻度，摇匀，配置成浓度为 5.13、10.26、20.52、51.30、76.96 μg/mL的标准系列，按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=25890X-27638.8，R2=0.9992，n=5。结果表明盐酸小檗碱在浓度为 5.13～76.96 μg/ mL 范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度 取同一批号样品(批号：20190912)6份，按样品溶液制备方法制备样品，照上述色谱条件及方法进行测定每份样品的含量，平均含量为2.2366 mg/g，RSD为1.81%表明该方法重复性良好。

2.2.6稳定性试验 精密吸取样品溶液5 μL，按上述色谱条件，分别于制备0、2、4、8、10、12 h进行色谱测定，记录色谱峰面积，从数据可见，样品中盐酸小檗碱在12 h内峰面积基本稳定不变，RSD为0.9%(n=6)。

2.2.7 加样回收率试验 取已知盐酸小檗碱含量的样品(批号：20190912 含量为2.2366 mg/g)粉末6份，每份约为0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入用(盐酸-甲醇1∶100)混合溶液配制的盐酸小檗碱对照品溶液(C=0.5029 mg/mL)1、1、1、2、2、2、4、4、4 mL，按照样品溶液制备方法制备样品溶液。按上述色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率，平均回收率为95.6%，RSD为1.8%(n=9)。结果见表1。

表1 盐酸小檗碱加样回收率试验结果

2.2.8 耐用性实验 用不同型号，不同厂家的色谱柱，取样品重0.5026 g的供试品，按样品溶液制备方法制备样品，以上述色谱条件进样，测定含量。结果见表2。

表2 不同色谱柱的耐用试验

2.2.9 样品测定 依据建立的盐酸小檗碱含量测定方法，对三批次(批号为20190920、20190912、20190905)泵嘎日-17中的盐酸小檗碱含量进行测定。样品测定结果见表3。

表3 三批样品中盐酸小檗碱含量测定结果

2.2.10 药材含量的测定 同法对生产上述三批样品的黄柏药材进行了含量测定，盐酸小檗碱的含量结果为39.3166 mg/g。测定结果见表4。

表4 三批样品中黄柏盐酸小檗碱的含量测定结果

3 讨论

3.1 指标成分的选择 黄柏具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，用于治疗湿热泄痢、黄疸尿赤、骨蒸劳热等症，而熊胆具有清热解毒、息风止痉、清肝明目的功效，其所含胆汁酸盐可显著增加胆汁分泌量，对总胆管、括约肌有松弛作用，鹅去氧胆酸有溶解胆结石的作用[6]。二者均对胆囊炎具有一定的治疗作用，故选择二者进行泵嘎日-17的质量控制指标。

3.2 含量测定检测波长的选择 通过考察盐酸小檗碱的紫外光谱得出，盐酸小檗碱在265 nm处有最大吸收，故含量测定选用265 nm作为含量测定的检测波长。

3.3 含量测定流动相的选择 前期预试验分别考察了甲醇-水(25∶75)、乙腈-水(25∶75)、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾(25∶75)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(25∶75)作为流动相，结果选用甲醇-水、乙腈-水为流动相时，盐酸小檗碱色谱峰型不理想，拖尾较严重；而甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾作为流动相时，由于甲醇在低波长处对盐酸小檗碱色谱峰型有干扰，没有乙腈作为流动相时的色谱峰理想，故选用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾(25∶75)作为流动相。

3.4 含量测定提取方法的选择 参照了2015年版《中国药典》大补阴丸的含量测定方法[7]，分别考察了以盐酸-甲醇(1∶100)的混合溶液为提取溶剂，15、30、45、45、60、75 min超声处理提取，结果发现盐酸小檗碱在超声提取30 min后含量基本不变，故确定超声提取时间为30 min。

3.5 含量测定转移率和含量范围 从样品含量测定结果和生产对应批次样品的药材含量测定结果分析比较，通过转移率与2015年版《中国药典》一部中黄柏盐酸小檗碱含量限值计算[7]，拟定泵嘎日-17中黄柏以盐酸小檗碱计，不得少于1.4 mg/g。

综上，研究利用薄层色谱法和高效液相色谱法，分别对泵嘎日-17中主药熊胆和黄柏进行了定性定量测定，建立了泵嘎日-17中熊胆和黄柏的质量控制方法，通过试验研究结果看出，薄层色谱对熊胆的定性鉴别方法科学、简便、专属性强；高效液相色谱法对黄柏的定量鉴别方法科学、稳定、重现性好。故本研究可对蒙药制剂泵嘎日-17的质量控制提供方法学基础，对促进蒙药标准化，提高蒙药发展水平具有一定的积极意义。