基于黏蛋白的表达研究慢性阻塞性肺疾病频繁急性加重型(肺脾气虚证)的发病特点

朱玉龙 刘莉娟

新疆维吾尔自治区中医医院呼吸科，新疆 乌鲁木齐 830000

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)在中医属于“肺胀、喘证、咳嗽”等范畴，是一种以气流受限为特征的疾病。气流受限不完全可逆、呈进行性发展，肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应，使之分泌过多黏液阻塞气道，从而导致的疾病急性发作。最新的研究结果显示，中国20岁以上成人的COPD患病率为8.6%，而40岁以上的患病率更是达到了13.7%[1]，影响着我国近一亿人的健康，且患病率有逐年上升的趋势[2-3]。

气道黏液高分泌是COPD等气道慢性炎症性疾病发病机制中最重要的病机之一，临床上常以痰液的分泌量以及痰液的性质分析作为治疗慢性肺部疾病的重要参考指标。呼吸道黏液大量分泌是炎症反应的结果，而黏液又是细菌良好培养基，断而形成恶性循环加重炎症反应和气流阻塞。黏液通过机械阻塞导致远端支气管管腔狭窄、气流阻塞，还可能通过替换肺泡内表面活性物质致终末细支气管壁塌陷，从而构成COPD的发病基础。若能解决气道黏液高分泌，或者降低黏液的黏稠度，避免黏液栓的形成，将可缓解COPD急性发作所带来的危害，是目前的研究热点之一。气道黏液中主要含有大分子黏蛋白，其是由MUC基因编码的富含丝氨酸苏氨酸的高分子量糖蛋白构成[4]。根据其结构不同可分为膜相关性黏蛋白、凝胶形成型分泌性黏蛋白及非凝胶形成型黏蛋白[5]。

常见的分泌型黏蛋白有MUC5AC、MUC5B、MUC7[6]。MUC 5AC是人体气道高分泌反应的主要物质，其对气道黏液高分泌反应具有重要的指导意义，是反应杯状细胞剧烈增值的一项重要指标[7]；MUC5B作为人体气道内影响纤毛运动的重要组成之一，对烟尘、细菌等外界物质起到运送至体外的作用，若因炎症反应不能消除，纤毛不能发挥生理作用，则会导致炎症在气道内反复发作，造成COPD的逐渐进展[8]；也有学者认为，MUC5B为唾液中的骨架蛋白，能够包裹唾液中的病毒从而清除，起到非特异性免疫应答的作用[9]。MUC7属于非凝胶型分泌蛋白，能与细菌结合形成的稳定的二硫键，使MUC7能够更加有效的稳定的清除细菌。同时在唾液中，MUC7拥有多个蛋白靶点，能更加广泛的覆盖口腔各部，对口腔各部的细菌等病原体起到清理作用[10]。在以往的研究中并没有相关报道说明MUC与COPD频繁急性加重有关，因此本研究通过对COPD急性加重期黏蛋白的变化，探讨研究COPD非频繁急性加重型与频繁急性加重型(肺脾气虚证)患者黏蛋白的变化特点。

1 资料与方法

1.1 病例来源 新疆医科大学附属中医医院2016年1月至2016年12月收住的COPD患者，根据上一年急性加重住院次数分为频繁急性加重型和非频繁急性加重型两组，并招募健康志愿者作为对照组。

1.2 病例选择标准

1.2.1 西医诊断标准 慢阻肺的诊断标准[11]：根据GOLD(The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，慢性阻塞性肺疾病全球倡议)2011修订版诊断标准：有慢性咳嗽、咳痰、呼吸困难及暴露于危险因素，应用短效支气管扩张剂后FEV1/FVC%<70%。COPD稳定期标准：患者咳痰、咳嗽、气促等临床症状轻微或稳定，且近3个月内无症状加重情况。

COPD频繁急性加重型诊断标准[12]：每年发作2次或以上，且每次发作都需要口服糖皮质激素和/或抗生素，或需要住院治疗的患者，每三年作为一个预期终点。患者咳痰、咳嗽、气促或喘息等临床症状加重，且咳痰量逐渐增多。

1.2.2 中医辨证分型标准 中医肺脾气虚证诊断标准[13]：《慢性阻塞性肺疾病中医诊疗指南(2011版)》制定。患者中医辨证属肺脾气虚；主症：咳嗽，喘息，气短，动则加重，纳呆，乏力，易感冒，舌体胖大、齿痕，舌质淡，舌苔白。次症：神疲，食少，脘腹胀满，便溏，自汗，恶风，脉沉、细、缓、弱。诊断： ①咳嗽或喘息、气短，动则加重； ②神疲、乏力或自汗，动则加重；③恶风，易感冒；④纳呆或食少；⑤胃脘胀满或腹胀或便溏； ⑥舌体胖大或有齿痕，舌苔薄白或白腻，脉沉细或沉缓或细弱。具备①、②、③中的2项，加④、⑤、⑥中的2项。

1.3 纳入标准 ① 符合慢阻肺西医诊断标准和稳定期诊断标准；②符合慢阻肺中医肺脾气虚证诊断标准；③年龄41～80岁；④患者签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①肺结核、支气管扩张、间质性肺病等可以引起起到阻塞或者气流受限疾病的患者；②心、肝、肾功能损害者；③精神疾病患者。

1.5 研究方法

1.5.1 主要试验仪器及试剂 酶联免疫吸附剂测定(ELISA)试剂盒购自武汉贝茵来生物有限公司，0.4%台盼蓝购自北京雷根生物技术有限公司，二硫苏糖醇(DTT)溶液购自上海樊克生物科技有限公司，EDTA购自苏州正洋化工科技有限公司，HE染色液购自北京索莱宝科技有限公司；唾液收集管及唾液采集管均购自上海朗赋实业有限公司的德国莎斯特(SARSTEDT)，Omni-SAI唾液采集片购自英国Cortecs诊断公司，机械式计数机购自浙江绍兴医疗器械厂，雾化器购自江苏鱼跃医疗设备股份有限公司，微量移液器购自德国艾本德股份公司。MUC5AC酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，MUC5B酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，Solarbio 伊红-苏木兰染色液，均购自武汉贝茵莱生物有限公司。

1.5.2 唾液的诱导处理 受检对象于清晨检测前30 min内禁食水，并在拟收集标本时，用清水漱口，再让患者口含英国Cortecs诊断公司的Omin-SAI唾液采集片，待采集片变为蓝色后，将其放置专用管内，室温下采用酶联免疫法吸附法对唾液中黏蛋白MUC5B、MUC7含量进行检测，试验过程严格按照试剂说明书上的操作进行。

2 统计方法

3 结果

3.1 患者基本资料 COPD频繁急性加重型组共纳入患者60例，其中男性30例，女性30例，年龄47～79岁，平均年龄(65.56±7.92)岁，病程2～20年，平均(9.5±1. 9)年；COPD非频繁急性加重型共纳入患者60例，其中男性30例，女性30例，年龄45～76岁，平均年龄(65.45±6.92)岁，病程3～19年，平均(9.3±1.7)年；健康人群纳入60例，其中男性30例，女性30例，年龄45～77岁，平均年龄(65.85±6.95)岁。两组以上资料在性别、年龄、病程等方面未见统计学差异(P>0.05)。

3.2 正常人、COPD非频繁急性加重型、频繁急性加重型患者唾液中MUC5B、MUC7的比较 与正常人唾液比较，非频繁急性加重期及频繁急性加重期患者唾液上清液中的黏蛋白MUC5B、MUC7的含量均升高，组间比较，差异有显著性统计学意义(P<0.01)；与非频繁急性加重期患者唾液比较，频繁急性加重期患者唾液上清液中的黏蛋白MUC5B、MUC7的含量均升高，组间比较，差异有显著性统计学意义(P<0.01)。结果见表1。

表1 正常人、非频繁急性加重型、频繁急性加重型患者唾液中MUC5B、MUC 7的比较

3.3 正常人、COPD非频繁急性加重型、频繁急性加重型患者唾液上清液中各细胞总数的比较 与正常人唾液比较，非频繁急性加重型及频繁急性加重型患者唾液中的中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数量均显著高于正常人，组间比较，差异有显著性统计学意义(P<0.01)；与非频繁急性加重型患者唾液比较，频繁急性加重型患者唾液上清液中的中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的数量均显著高于非频繁急性加重型患者，组间比较，差异有显著性统计学意义(P<0.01)。结果见表2。

表2 正常人、非频繁急性加重型、频繁急性加重型患者唾液上清液中各细胞总数的比较 (个，

4 讨论

COPD在中医学中被称为“肺胀”。“肺胀”一词的提出最早是在《灵枢·胀论》中，“肺胀者，虚满而喘咳”[14]。张仲景在《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》中进一步描述了肺胀的病机及症状，本病的病机以肺脾肾亏虚为本，痰瘀互结为标，二者共同引起的本虚标实；《素问·咳论》中提到，“五脏六腑，皆令人咳，非独肺也”，浅析其意，脾脏为后天之本，生化之源，运化水谷精微，内养五脏六腑，外养四肢百骸，脾精不濡，肺失所养，乃致其病[15]。俞琪等[16]对既往报道的肺胀的证型进行归纳发现，肺脾气虚在COPD的证型占比最高，临床中亦有医家在研究中得出相似的结论。中医研究发现 COPD 频繁急性加重型稳定期的主要病位在肺、脾、肾三脏，其根源在于肺气亏虚，肺脾二脏为母子关系，“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”，肺脾二脏气虚及痰的存在构成 COPD 的主要发病基础，肺脾气虚证是其主要证型之一，因此，虽COPD在发病中证型各不相同，但临床中以肺脾气虚多见。

COPD的发病与气道黏液的高分泌有关，在COPD患者使用化痰药物时，会影响黏蛋白的产生，从而减轻黏液高分泌的状态[17]。因此，气道的黏液分泌是引发疾病的重要因素之一[18-19]。本实验从COPD非频繁急性加重型和频繁急性加重型患者分别与体检健康人群的唾液中MUC7及MUC5B的分泌对比发现，COPD非频繁急性加重型和频繁急性加重型患者的黏蛋白均高于正常人组，在MUC5B中非频繁急性加重型患者稍高于正常人群，频繁急性加重型患者明显升高，更具有指导意义。MUC7在非频繁急性加重型及频繁急性加重型均明显高于正常人群，在唾液中更具有代表性，患者频繁急性加重型的MUC5B及MUC7均明显高于非频繁急性加重型患者，提示频繁急性加重型气道黏液高分泌状态较非频繁急性加重型患者更为强烈。

COPD的疾病发展除对气道黏液高分泌相关外，也与炎症细胞反应分泌的介质密切相关。主要由嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症。其中炎症反应与中性粒细胞呈正相关关系[20]，当急性发作期时，中性粒细胞与主要的趋化因子IL-8相结合，引起中性粒细胞的趋化，变形释放，进一步导致炎症的形成。COPD频繁急性发作期时，肥大细胞激活嗜酸性粒细胞趋化因子[21]，使细胞聚集，引起炎性细胞介质的释放，加重炎症反应。而MUC5B作为人体气道内影响纤毛运动的重要组成之一，对烟尘、细菌等外界物质起到运送至体外的作用，若因炎症反应不能消除，纤毛不能发挥生理作用，则会导致炎症在气道内反复发生，造成COPD的逐渐进展[8]，进而加重COPD患者的病情。本实验研究发现，在COPD频繁急性加重型及非频繁急性加重型患者唾液中中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞均高于体检正常人群，差异有统计学意义，且COPD两组患者均为成倍增高，其中频繁急性加重型患者的炎症因子高于非频繁急性加重型患者，提示COPD组患者体内慢性炎症的存在，并且在频繁急性加重型患者中，其慢性炎症更为严重，这对于临床医者指导用药有更重要的意义，在频繁急性加重型及非频繁急性加重型患者中均要考虑慢性炎症的用药，同时，在频繁急性加重型中，要加强抗炎的治疗，以使临床治疗COPD收获更好的疗效。