天津市畜禽粪污处理工艺对抗生素抗性基因的去除效果

闫雷，丁工尧，杨凤霞，阮蓉，韩秉君，支苏丽*，张克强*

（1.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030；2.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；3.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134）

由于抗生素具有提高畜禽生长速度、预防和治疗畜禽疾病的作用，因此其在畜禽养殖场中的使用较为广泛，据专家统计，我国用于畜禽养殖业方面的抗生素占全国抗生素总使用量的52%[1]。但大量与长期使用抗生素会增加畜禽肠道中耐药菌的产生与累积，耐药菌与粪便共同进入环境，使畜禽粪便成为环境中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的重要来源[2]。此外，由于ARGs 不仅在垂直转移方式上可亲代传递，其还具有水平转移的能力，可在养殖场周边的环境介质微生物中传播和扩散[3]，甚至会扩散到致使人类患病的细菌中，从而威胁到人类健康[4]。已有很多学者对不同畜禽养殖场及周边环境中ARGs 的污染状况进行了研究，研究主要集中在畜禽养殖场粪便、污水以及粪肥还田后土壤中ARGs 的污染丰度和种类方面。例如，闫书海[5]对浙江和杭州不同规模养殖场（猪、鸡和鸭）的粪便和污水中2 类典型ARGs 进行检测，发现四环素类的tetA、tetG、tetM、tetO、tetQ、tetW 与磺胺类的sul1、sul2 在所有样品中均有检出，且磺胺类ARGs 的相对丰度普遍高于四环素类；彭晶等[6]在施粪肥后的土壤中检出了大环内酯类中的erm35、ermB、ermT、ermX、ermF 和erm36，其中丰度最高和最低的分别为ermB 和erm36；MCKINNEY等[7]在猪场和鸡场氧化塘沉积物中检测出磺胺类ARGs（sul1 和sul2）和四环素类 ARGs（tetO 和tetW），且含量为猪场高于鸡场；YUAN 等[8]在武汉畜禽养殖场的废水中检测到了四环素类tetA、磺胺类sul1 以及喹诺酮类oqxB 等常见的ARGs。

综上所述，目前国内外研究主要聚焦于ARGs 的污染水平和种类等污染特征分析。然而，随着集约化养殖场的发展和在环保要求下，畜禽养殖场采用的不同粪污处理工艺，粪污中污染物的转归和降解日益受到重视，但是这些粪污处理工艺对ARGs 的去除效果仍不太清楚，尤其是完全针对畜禽养殖场粪便和污水不同处理工艺中ARGs 的赋存规律与去除效果的研究十分有限。因此，本文以天津市猪场、牛场、鸡场中典型粪污处理工艺为研究对象，研究目的：（1）分析不同畜禽养殖场新鲜粪污中ARGs 的总体污染特征；（2）探讨不同养殖场污水处理工艺对ARGs 的总体去除效果，以及不同处理单元中ARGs 的赋存规律；（3）比较不同粪便处理工艺对ARGs 的去除效果，以及关键环节中ARGs 的赋存规律。从而为控制我国畜禽养殖场中ARGs 污染与减少周边环境耐药性传播提供科学依据，为养殖场粪污中ARGs 的消减提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 养殖场的基本信息

本次试验选取天津市具有较为常见、通用和完整的粪污处理工艺的3 类畜禽养殖场为研究对象，其中牛场粪便的处理方式主要是堆肥和灭菌晾晒作垫料，两者基本原理均为好氧发酵，区别主要是灭菌作垫料处理是为了保护牛的健康增加灭菌流程；鸡场粪便的处理方式为堆肥；猪场使用异位发酵床对畜禽粪便进行处理，异位发酵床与堆肥基本原理均为好氧发酵，但异位发酵床中有芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等多种菌株参与。牛场和猪场对污水的处理方式都主要以厌氧发酵为主。三家养殖场粪污处理工艺流程如图1所示。

牛场，猪场和鸡场的地理位置分别为39°14′29″N、117°34′12″E，39°21′31″N、117°46′01″E 和39°44′33″N、117°14′18″E；存栏量分别为2 000、1 500 头和600 000 只；粪便日排放量分别为4 000、30 000 kg·d-1和60 000 kg·d-1，牛场和猪场污水日排放量分别为20 000 L·d-1和72 000 L·d-1。

1.2 样品的采集、运输和保存

试验样品采集于2019年7月上旬，采集的样品为畜禽新鲜粪污，以及各处理单元中粪污，具体采样点如图1 所示。采集液体样品时，均设置多点采集，然后混合均匀为1 份样品，连续采样3 d，作为每个采样点的3 个平行样品，共计27 个样品（猪场12 个和牛场15 个）；固体样品为多点采集并混合为均一样品，不同采样点采集3 个平行样品，共计45 个样品（猪场9个、牛场15 个和鸡场21 个）。采集后的样品放到含有冰袋的白色泡沫箱中，低温储存，5 h 内送到实验室-20 ℃的冰箱保存，等待处理。

1.3 样品的预处理

固体样品放入冷冻干燥机中去除水分，并将得到的干样磨碎，混合，过2 mm 的网筛，液体样品过5µm滤膜以去除漂浮的杂质。在提取DNA 前，将样品于-20 ℃冷冻储存。

1.4 基因组DNA的提取与PCR反应

试验使用的Fast DNA SPIN Kit for soil 试剂盒购买于美国MP Biomedicals 生物医药公司，对样品DNA的提取严格遵守试剂盒的操作指南，提取出DNA 的纯度采用超微量紫外可见分光光度计检测。以目标DNA 模板进行 PCR 检测，PCR 反应体系为 25 µL，包括12.5 µL 2×EasyTaq PCR SuperMix（0.1 U·μL-1Taq DNA Polymerase、2×PCR buffer、3 mmol·L-1MgCl2和0.4 mmol·L-1dNTPs），前后端引物各0.5 µL（10 μmol·L-1），0.5 µL DNA 模板和 11 µL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 30 s，退火 30 s 后，72 ℃延伸30 s，共35 个循环。基因引物的详细信息如表1所示。反应结束后，采用DNA 凝胶电泳检测，观察条带是否有目的基因存在。

表1 PCR引物的详细信息Table 1 The detail information of PCR primer

1.5 实时荧光定量（qPCR）检测

试验检测目标包含四环素类（tetX、tetW、tetQ、tetO 和tetL）、磺胺类（sul1 和sul2）、大环内酯类（ermB和ermC）、喹诺酮类（oqxB、qnrB 和qnrS）、链霉素类（strA）抗性基因以及基因元件intI1，PCR 引物的详细信息如表 1 所示。qPCR 的反应体系为 20 µL：TB Green Premix Ex Taq 10.0 µL、前后端引物各0.4 µL、ROX Reference DyeⅡ0.4 µL、ddH2O 6.8 µL 和DNA 模板（已稀释10 倍）2 µL（对照以ddH2O 为模板），3 个平行，用7500 实时荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems美国）进行实时qPCR 检测。qPCR 扩增过程：95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 34 s，40 个循环。在60~95 ℃之间进行熔点曲线分析，根据标准曲线[9]计算出目标基因的拷贝数，随后计算出目的基因的相对丰度（ARGs 拷贝数/16S rRNA 基因拷贝数）。抗性基因去除率计算公式：

式中：j表示特定的基因为基因j处理前的相对丰度为基因j处理后的相对丰度。

1.6 数据分析

相对丰度、平均值、标准差和lg 值在Excel 2007中计算；使用R 软件的Pheatmap 制作热图；堆积柱状图使用Origin2017绘制；采样流程图使用Word绘制。

2 结果与讨论

2.1 不同畜禽养殖场原始粪污中ARGs的污染特征

新鲜粪污中ARGs 的丰度和种类如图2 所示，13种ARGs 与intI1 在被检测样品中全部检出，这表明目标ARGs 在畜禽养殖场粪污中普遍存在。值得注意的是，在养殖场粪污的5 类ARGs 中，喹诺酮类ARGs的相对丰度最低，为10-7~10-5，四环素类和磺胺类ARGs 的相对丰度普遍较高，分别为10-4~10-1和10-4~10-2，其原因可能是养殖场粪污中四环素和磺胺类抗生素残留水平较高。例如，阮蓉等[18]在检测天津市20家牛场、猪场和鸡场粪污中的抗生素残留情况后，发现3 种畜禽养殖场中四环素类抗生素污染水平较高，这可能是导致四环素类ARGs 污染水平较高的原因。对于不同畜禽粪便，3 个畜种养殖场粪便中ARGs 的污染特征有较大差异，鸡场和猪场粪便中大环内酯类ARGs 的相对丰度（10-4~10-2）明显高于牛场（10-6~10-5）；鸡场和牛场中磺胺类ARGs 的相对丰度（4.85×10-4~1.36×10-3）低于猪场（1.36×10-3~3.63×10-3）。此外，鸡场和猪场粪便中目标四环素类ARGs 的相对丰度普遍较高（10-4~10-1），这与邹威等[19]对华北地区鸡场和猪场粪便中ARGs 的相对丰度比较后的结果相似，这可能与四环素类抗生素使用量大以及该类ARGs较高的水平扩散能力有关。猪场和牛场污水中ARGs 的污染特征如图 2 中 PW 和 CW 所示，除喹诺酮类外，其他类ARGs 污染水平普遍较高，这说明养殖污水同样是ARGs 的储存库。值得注意的是，猪场污水中四环素类、磺胺类和大环内酯类ARGs 的相对丰度（10-3~10-2）明显高于牛场的（10-6~10-4），这与ZHANG 等[20]对猪场和牛场污水中ARGs 丰度的对比结果一致。

2.2 猪场和牛场污水处理工艺对ARGs的去除效果

2.2.1 猪场污水中ARGs的去除效果

猪场污水各处理单元中13 种ARGs 和基因元件intI1 的相对丰度如图3（A）所示，除在氧化塘中未检出qnrB 外，其余ARGs 均在所有处理单元中检出。5类目标ARGs 中，喹诺酮类ARGs 的相对丰度最低，为4.31×10-7~9.61×10-5，其余 ARGs 的相对丰度普遍较高，其中四环素类 ARGs 中tetO 和tetL（10-3~10-2）普遍高于tetX 和tetQ（10-4~10-3），大环内酯类ermB 的相对丰度（10-3~10-2）普遍高于ermC（10-4~10-2）。

表2 为猪场污水中13 种ARGs 及基因元件intI1在各处理单元中的去除效果和总去除效果。首先分析猪场污水处理系统对ARGs 的总体去除情况，其中tetX、tetW、tetQ、tetO、tetL、ermC、ermB 和sul1 总体呈现正去除效果，相对丰度（lg 值）下降了0.06（tetO）~1.53（tetW），而sul2、qnrS、qnrB、oqxB 和strA 的相对丰度（lg值）上升了 0.03（strA）~1.19（qnrB）。CHEN 等[21]发现厌氧发酵处理对江苏省猪场污水中四环素类tetW、tetQ、tetO 与大环内酯类ermC、ermB 有良好的去除效果，同时未能有效去除喹诺酮类qnrS、oqxB 与磺胺类sul1、sul2，与本试验的结果一致。intI1 相对丰度（lg值）增加了0.09。此外，不同处理单元对ARGs的去除效果不同，ARGs 去除效果最好的主要集中在厌氧发酵池和贮存池，其中贮存池为该处理工艺的最后一环，污水储存的时间较长，可继续进行厌氧或兼性厌氧等发酵反应，此外，污水中微生物群落的变化，同样可能对ARGs 产生一定的降解作用。tetX、tetW、tetQ、tetO、sul1、ermC 和ermB 在厌氧发酵单元中降低较多，其中tetW 的去除效果最好，相对丰度（lg 值）下降了1.12；tetQ、sul2、qnrS、oqxB 和ermC 的相对丰度在贮存池单元中下降较多，其中sul2 和oqxB 的去除效果最好，相对丰度（lg值）均下降了0.59。

表2 猪场污水中ARGs在不同处理单元中的去除效果（lg值）Table 2 Removal effect of ARGs in pig farm sewage in different treatment units（lgs）

2.2.2 牛场污水中ARGs的去除效果

如图 3（B）所示，在对牛场污水中 13 种 ARGs 及基因元件intI1 检测后发现，除了oqxB 和ermB 外，其余目标ARGs 在所有处理单元中均有检出，其中磺胺类ARGs 相对丰度最高，为6.83×10-4~1.73×10-2；喹诺酮类ARGs 相对丰度最低，为3.92×10-7~2.45×10-6，此外，四环素类 ARGs 中tetX、tetW、tetQ 和tetO（10-4~10-3）的相对丰度高于tetL（10-5~10-3），大环内酯类ermB（10-4）的相对丰度高于ermC（10-6）。

表3 为牛场废水中13 种ARGs 及基因元件intI1在各处理单元中的去除效果和总去除效果，其中tetX、tetW、tetQ、tetO、tetL 和ermC 总体呈现正去除效果，相对丰度（lg 值）降低了0.002（tetX）~2.09（tetL）；其余ARGs 均表现出富集现象，其中相对丰度升高最多的为qnrS 和qnrB，lg 值均升高了0.76，这可能与这几种ARGs 的宿主微生物在不同环境条件下具有较强的生存能力有关。此外，ARGs 在调节池单元中的去除效果优于其他处理单元，tetX、tetW、tetQ、te⁃tO、sul2、qnrB 和strA 在该处理单元中相对丰度均呈现下降趋势，其 lg 值下降了 0.22（sul2）~0.63（tetQ）。分离池中 ARGs 去除效果最差，13 种 ARGs 中有 9 种（除qnrB 和qnrS 外）出现富集现象，其中tetO 的相对丰度增加最多（0.72），另外在该单元中，基因元件intI1 虽有所去除，但相对丰度（lg值）仅下降了0.01。

表3 牛场污水中ARGs在不同处理单元中的去除效果（lg值）Table 3 Removal effect of ARGs in cattle farm sewage in different treatment units（lgs）

综上所述，畜禽养殖污水处理各单元中ARGs 普遍存在，猪场污水中ARGs 的检出率为97%，牛场污水中的检出率为95%。猪场和牛场污水处理工艺对ARGs 的去除效果有较大差异，猪场污水在厌氧发酵后，8种ARGs的相对丰度下降，lg值平均下降了0.81；牛场污水中6 种ARGs 的相对丰度下降，lg 值平均下降了0.57，值得注意的是，猪场和牛场的污水处理工艺对5 种四环素类ARGs 均呈现正去除效果，下降最多的为tetL（2.09）；此外，猪场污水工艺对tetX、tetW、tetQ、sul1、ermC 和ermB 的去除效果优于牛场处理工艺，而对tetO 和tetL 去除能力，则是牛场优于猪场。

2.3 猪场、牛场和鸡场粪便处理工艺对ARGs 的去除效果

2.3.1 猪场粪便处理工艺对ARGs的去除效果

图4（A）为猪场粪便处理工艺各单元中ARGs 的污染情况及赋存规律。13 种ARGs 及基因元件intI1中，除了部分样品中喹诺酮类qnrS、qnrB 和oqxB 未检出外，其他目标ARGs均有检出，其中tetO相对丰度最高，为2.42×10-3~1.17×10-1，qnrB 的相对丰度最低，为6.02×10-6~1.68×10-3，此外，sul1、sul2、strA 和intI1 在不同处理单元中的相对丰度的数量级没有变化。

经过粪便处理工艺后，13种目标ARGs 以及基因元件intI1 的去除效果见表4。结果表明，处理后的粪便与原始粪便相比，13种目标ARGs以及intI1的相对丰度普遍降低，只有tetX、sul1 和sul2 出现富集现象，其中tetX 的富集现象最为明显，相对丰度的lg值升高了1.08，该工艺对其余4 种四环素类ARGs 有良好的去除效果，相对丰度（lg 值）下降了1.57（tetL）~1.93（tetQ），此外该工艺对粪便中大环内酯类ermC和ermB的去除效果有较大差异，对ermC 的去除效果优于ermB，基因元件intI1 虽为正去除，但相对丰度（lg 值）仅下降了0.04。GUO 等[22]发现在猪粪堆肥后，其中四环素类ARGs和大环内酯类ARGs的丰度会降低，其中tetW和ermC的丰度减少90%以上；TAO等[23]对猪场常温堆肥的研究发现，在完成堆肥后磺胺类sul1 和sul2的丰度（lg值）上升1.11~2.49，ZHANG等[24]在研究猪粪堆肥样品时也得出了类似结果。

表4 猪场粪便中ARGs在各处理单元中的去除效果（lg值）Table 4 Removal effect of ARGs in pig feces in each treatment units（lgs）

2.3.2 牛场粪便处理工艺对ARGs的去除效果

经过处理工艺后，牛场粪便中ARGs 相对丰度的变化如图4（B）所示。在不同处理单元中，磺胺类sul1和sul2 的相对丰度最高，为1.51×10-3~4.42×10-2，喹诺酮类qnrS、qnrB 和oqxB 的相对丰度最低，为 1.68×10-6~3.21×10-5。同类型ARGs 的相对丰度存在较大差异，四环素类tetX、tetW 和tetL（10-4~10-3）的相对丰度 高 于tetO 和tetQ（10-6~10-3），大 环 内 酯 类ermB（10-4~10-2）高于ermC（10-5~10-6），此外，链霉素类strA和基因元件intI1 在整个粪便处理过程中相对丰度的数量级没有变化，分别为10-3和10-4。

牛场粪便中13 种目标ARGs 以及基因元件intI1的去除效果如表5 所示。通过比较两种处理手段下ARGs的去除效果发现，牛场粪便在经过堆肥处理后，13 种 ARGs 中有 9 种的相对丰度（lg 值）下降了 0.02（oqxB）~3.05（tetQ）；4 种的相对丰度（lg 值）上升了0.01（sul1）~0.63（ermC）；intI1 的相对丰度（lg 值）下降了0.42。而粪便在经过无菌晾晒处理后，有5 种ARGs的含量降低，相对丰度（lg值）下降了0.39（tetX）~2.52（ermB）；7 种相对丰度（lg 值）上升了0.06（ermC）~1.04（tetL）；intI1的相对丰度（lg值）升高了0.09，值得注意的是，牛粪在经过灭菌处理后，部分ARGs 出现富集现象，其原因可能是高温灭菌处理（50~60 ℃）虽然可以消除部分致病菌，但是也可能会促进部分细菌增殖，从而造成耐药基因丰度升高。总体而言，相对于晾晒处理，堆肥处理可能对牛粪中ARGs 有更好的去除效果。此外，在堆肥处理后，5 种目标四环素类ARGs丰度降低趋势明显，lg值下降了0.35~3.05，这与DIEHL 等[25]对牛场堆肥发酵的结果一致，表明堆肥发酵处理可能对大部分四环素类ARGs 有较好的去除效果；磺胺类ARGs 和喹诺酮类ARGs 的去除效果不理想；大环内酯类ermB 表现出正去除效果，相对丰度（lg 值）下降了0.97，这与彭晶等[26]对牛粪堆肥后大环内酯类ARGs 丰度变化的研究结果不一致，这可能与牛粪堆肥原料、堆肥环境以及微生物群落组成的差异有关。

表5 牛场粪便中ARGs在各处理单元中的去除效果（lg值）Table 5 Removal effect of ARGs in cattle feces in each treatment unit（lgs）

2.3.3 堆肥处理对鸡粪中ARGs的去除效果

随时间变化，好氧堆肥后鸡粪中ARGs 相对丰度的变化规律及污染特征如图4（C）所示。在13 种ARGs 中，喹诺酮类ARGs 的含量最低，相对丰度为3.72×10-7~5.04×10-5，其余目标ARGs的相对丰度均在10-5以上，其中同类ARGs 的含量也有差异，磺胺类的相对丰度sul2（10-4~10-2）高于sul1（10-4~10-3），大环内酯类的相对丰度ermB（10-4~10-2）高于ermC（10-4~10-3），此外基因元件intI1 的相对丰度为 4.14×10-5~7.21×10-4。

不同堆肥时间下，粪便中ARGs 的相对丰度变化如表6 所示。在 13 种目标 ARGs 中，tetW、tetQ、tetO、qnrS、oqxB、ermB和strA的相对丰度（lg值）下降了0.27（oqxB）~2.85（tetO），而tetX、tetL、sul1、sul2 和ermC 出现富集现象，相对丰度（lg 值）上升了0.03（tetX）~1.52（sul2），这说明堆肥可能成为了部分ARGs 含量增加的良好反应器。就去除不同种类ARGs 而言，好氧堆肥对四环素类ARGs 的去除效果高于其余ARGs，其中tetW、tetQ和tetO的去除效果最好，相对丰度（lg值）下降了1.20~2.85；磺胺类sul1 和sul2 呈现负去除效果，相对丰度（lg 值）上升了0.96 和1.52；大环内酯类ARGs 的去除效果有明显差异，其中ermC 出现富集现象，相对丰度（lg 值）升高了1.43，而ermB 的相对丰度（lg 值）下降了1.83。LI 等[27]在对堆肥26 d 后的鸡粪检测中发现，tetW 和ermB 等四环素类与大环内酯类ARGs 的相对丰度降低，磺胺类sul1 的相对丰度升高了7.5 倍，与本试验ARGs 的相对丰度的变化相似。此外，基因元件intI1 的相对丰度（lg 值）上升了1.24，SELVAM 等[28]研究了高温条件下鸡粪堆肥后ARGs 的变化，发现intI1 明显增值，与本试验的结果一致。值得注意的是，不同堆肥时间，粪便中ARGs 的相对丰度呈现波动式变化，第2 d，目标ARGs 整体呈现下降趋势，第4 d ARGs 整体出现富集现象，其中ermB 的相对丰度升高最多，第8 d 所有ARGs 和intI1 的相对丰度均下降，而第16 d ARGs以及intI1 的相对丰度（lg 值）上升了0.14~1.03。在堆肥过程中，ARGs 的相对丰度出现上下波动现象，这可能是由于不同堆肥时期的微生物群落变化的原因[29]。

表6 鸡场粪便中ARGs在堆肥处理中的去除效果（lg值）Table 6 Removal effect of ARGs in chicken feces during composting（lgs）

综上所述，3 种养殖场处理工艺对畜禽粪便中ARGs 的去除效果有较大差异，但总体对ARGs 表现出良好的去除效果，均可以有效去除四环素类ARGs和大环内酯类ermB，但无法有效去除磺胺类ARGs 和大环内酯类ermC。值得注意的是，猪场粪便在经过异位发酵床处理后，10 种ARGs 的相对丰度（lg 值）平均下降了1.11；牛场粪便在堆肥后，9 种ARGs 的相对丰度（lg 值）平均下降了0.83，在灭菌作垫料后，5 种ARGs的相对丰度（lg 值）平均下降了1.12；鸡场粪便堆肥后，8种ARGs的相对丰度（lg值）平均下降了1.32。

3 结论

（1）畜禽养殖场粪便和污水中抗生素抗性基因普遍存在（10-7~10-1），但不同畜禽养殖场粪便中ARGs的污染程度存在差异，猪场污水中ARGs 的污染水平普遍高于牛场。

（2）经过不同污水处理单元后，猪场和牛场对四环素类ARGs 的去除效果相对较好，且相对于牛场，猪场污水处理工艺对ARGs 有更强的去除效果；厌氧发酵单元、贮存池单元和调节池单元可能对ARGs 去除起到较大作用。

（3）3 种养殖场的粪便处理工艺对四环素类ARGs 的去除效果较好，对磺胺类ARGs 的去除效果较差。