高血糖及血糖波动对糖尿病小鼠甲状腺激素的影响及机制

吴菲，叶鹏，杜宏

（1.南阳市中心医院内分泌科，河南 南阳 473000；2.南阳市中心医院乳腺外科，河南 南阳 473000；3.东部战区总医院内分泌科，江苏 南京 210000）

随着对糖尿病（DM）研究的不断深入，发现糖尿病患者体内的甲状腺激素（TH）的分泌也存在异常情况，其中以游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）水平下降最为常见[1]。研究[2,3]认为甲状腺激素水平低下，尤其是FT3 下降与糖尿病肾病（DKD）的不良预后密切相关。因此，DM患者的甲状腺激素异常越来越受到人们的关注。

高血糖是糖尿病患者的主要临床特征。HbA1c的代谢周期长于甲状腺激素的代谢周期，因此可较好地反映一段时间内血糖对甲状腺激素水平的影响。既往研究指出，持续高血糖即血糖控制不佳的T2DM患者T3水平下降,待血糖控制良好后，T3逐渐上升[4]。尽管HbA1c与DM 并发症具有密切的关系,但它只能解释部分糖尿病并发症风险变化,以HbAlc 作为血糖控制唯一指标并不能有效减少糖尿病患者并发症发生的风险[5]。目前已有越来越多的研究[6]表明血糖波动可能为独立于HbAlc的糖尿病慢性并发症的危险因素。血糖波动性又称血糖变异性，是指血糖水平在其波峰和低谷之间变化的不稳定状态[7]。岳欣等[8]在临床中发现初诊T2DM患者存在T3、FT3水平下降，rT3水平上升，且与血糖波动情况有关。说明DM患者的甲状腺激素异常不仅与高血糖有关，与血糖波动也有着密不可分的关系。

因此，文章旨在通过动物实验分析持续高血糖及血糖波动与甲状腺激素的关系及其机制，从而来填补有关这一方面研究的空缺。

2 材料与方法

2.1 材料 清洁级6～8 周龄C57 雄性小鼠34 只，体重20～24g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，采用SPF 级屏障系统小鼠实验饲养室饲养，许可证号为SCXK（苏）2016-0010。小鼠饲养笼中给予充足的水和饲料，自由进食。小鼠常规饲料由东部战区总医院动物实验中心提供，普通胰岛素注射液由美国礼来公司提供。链脲佐菌素（STZ）购于美 国sigma公司。FT3、FT4、TSH 试剂盒及小鼠HbA1c、ID1 ELISA 试剂盒均购于厦门慧嘉生物有限公司。0.1mol/l 柠檬酸钠缓冲液配制：将2.10g 柠檬酸加入双蒸水100ml 配成柠檬酸母液，称为A液；将2.94g 柠檬酸二钠加入双蒸水100ml 配成柠檬酸钠母液，称为B 液；将A 液和B 液按1:1的比例混合，然后稀释为100ml。STZ 溶液配制：将STZ溶于0.1mol/l的柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成浓度为10mg/ml的溶液。避光配制，现配现用。

2.2 方法

2.2.1 动物分组与建模 所有小鼠适应性喂养两周后随机分为模型组22 只，对照组（C 组）12 只。糖尿病小鼠模型：模型组小鼠禁食不禁水12h 后（晚上9 点禁食，早上9 点注射STZ），尾静脉测空腹血糖，称体重，然后按50mg/kg/d 腹腔注射STZ，再继续禁食2 小时，连续注射五天。对照组给予同等量的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。一周后模型组小鼠随机血糖均超过16.7mmol/l，DM 模型造模成功。血糖波动小鼠模型：将模型组小鼠分为持续高血糖组（D 组）10 只及血糖波动组（DF 组）12 只，血糖波动组小鼠每日09：00 腹腔注射葡萄糖注射液2g/kg，注射葡萄糖0.5h 后，血糖达到峰值，此时注射胰岛素0.5u-1u，血糖在1.5h 内降至最低值，14：00时血糖恢复到注射葡萄糖前其血糖水平，一天内形成一次高峰与低谷。造模期间随机监测小鼠的血糖，血糖较低或偏高时立即给予适量的葡萄糖或胰岛素。D 组和C 组则给予腹腔注射等体积的生理盐水。在造模六周后尾静脉采血测全天（8:00、8:30、10:00、14:00、14:30、16:00、20:00）血 糖，分 别计算三组小鼠血糖水平标准差（SD）及平均血糖波动幅度（MAGE）。

2.2.2 生化指标检测 六周末监测全天血糖后禁食12h,于次日处死小鼠，处死前尾静脉检测空腹血糖及称量体重，内眦取血后离心得血清，使用小鼠FT3、FT4、TSH 试剂盒检测甲状腺激素水平，小鼠HbA1c 试剂盒检测其糖化血红蛋白，麻醉后取肝脏组织，匀浆后取上清，小鼠ID1 试剂盒检测肝脏组织的ID1 活性。

2.2.3 统计分析 采用SPSS23.0 软件统计分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间较采用单因素Anova 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 三组小鼠的一般特征 D 组与DF 组小鼠精神状态差，反应迟钝，活动减少，失去光泽，脱发和烦渴，多尿和多食的症状均较明显。三组间小鼠体重差异无统计学意义，见表1。

3.2 三组小鼠血糖水平和血糖波动参数的比较六周造模期间，每周末监测三组小鼠全天血糖，并分别计算平均值，可以看出，DF 组小鼠的血糖在8:30 时升至最高水平，在10:00 降至最低水平，14:00血糖恢复至初始水平，血糖在1 天内形成了明显的高峰和低谷。与DF 组相比，D和C 组小鼠的血糖变化趋势则相对平稳，见图1。

图1 三组小鼠血糖波动情况

同时，与C 组相比，D 组小鼠的HbA1c水平明显升高，而DF 组的HbA1c与C 组相比无显着性差异。DF 组和D 组小鼠血糖标准差（SD）和平均血糖波动幅度（MAGE）均明显高于C 组，DF 组与D组相比，SD和MAGE水平也明显升高，见表1。

表1 三组小鼠一般特征的比较

3.3 三组小鼠甲状腺激素水平的比较 D和DF 组小鼠与C 组相比，FT3水平均明显降低，各组间FT4和TSH水平无显著差异；D 组与DF 组相比，各项甲状腺激素指标均无明显变化，见表2。

表2 三组小鼠甲状腺激素水平的比较

3.4 三组小鼠肝脏ID1水平的比较 DF 组和D 组小鼠ID1 均低于C 组（P＜0.01）；D 组、DF 组之间差异无统计学意义，见表3。

表3 三组小鼠肝脏ID1水平的比较

4 讨论

目前关于糖尿病小鼠造模有多种方法,在此研究中,我们通过给小鼠腹腔注射STZ 成功地导致了糖尿病状态[9]，即模型组出现了明显的多饮、多食、多尿症状，活动减弱，一般状态较差。就血糖控制而言，D 组的HbA1c 最高，而DF 组与C 组没有显示出统计学差异,这是因为在制作血糖波动模型的过程中给DF 组小鼠注射了胰岛素，因此，DF 组小鼠的糖化血红蛋白水平控制在正常范围内,但血糖波动水平明显高于C 组。体内血糖值在高峰与低谷之间波动的不稳定状态即为血糖波动,血糖波动幅度的增大可加重糖代谢的障碍[10]。目前评估血糖波动的指标很多，包括MAGE、平均血糖（MBG）、SD 等，其中常用的指标是SD、MAGE，均是评估血糖稳定性的简易参数。本研究通过监测小鼠的全天血糖并使用Service[11]提出的方法计算得出MA GE、SD，发现三组小鼠的血糖波动幅度均有统计学差异,其中以DF 组小鼠的血糖波动最为明显，说明通过错时给予葡萄糖及胰岛素的方法可以成功地建立血糖波动小鼠模型。

流行病学资料显示，DM患者甲状腺功能异常的发生率是非DM患者的2～3 倍[12],并且大多数D M患者的甲状腺激素水平主要表现为FT3水平降低[13]。与既往研究结果一致，本实验发现糖尿病小鼠具有明显的低FT3 血症，提示糖尿病状态可导致小鼠甲状腺激素异常，但对其机制目前说法不一。糖尿病已经被认为是一种炎症性疾病，随着患者体内的白介素-1 (IL-1)、IL-6 等细胞因子的增多，影响了T3 等合成、转运、释放过程[14]。另外，也有人提出碘泵功能的障碍也可以导致甲状腺功能紊乱。由此可见，糖尿病中甲状腺激素的异常可能是多种因素综合的结果。本文从动物实验证实了糖尿病的甲状腺激素异常的机制与肝脏脱碘酶的活性受到了抑制有关，并将其归因于糖尿病的糖代谢紊乱[15]。根据其催化机制，反应和抑制动力学及底物特异性不同，脱碘酶可以分为三种类型，即脱碘酶1,2,3型(ID1,ID2和ID3)[16]。其中，脱碘酶1（ID1）控制FT4 向FT3的转化，从而提供血浆中大部分循环的FT3[17]。ID1 存在于许多组织中，包括肝脏，肾脏和甲状腺，研究报道，肝脏中ID1 活性比其他组织大约高3 倍[18]。本研究发现D 组小鼠的肝脏ID1 活性较C 组明显降低，而大部分T3 是来源于外周组织如肝脏的ID1对T4的脱碘转化而来的[19]，因此进一步证实了高血糖[20]导致肝脏ID1 活性的下降是血清中FT3 下降的重要途径之一。

同时，本研究还探究了血糖波动对小鼠甲状腺激素及ID1 活性的影响，DF 组小鼠的FT3、ID1活性也较C 组有所下降，且差异均有统计学意义，说明了血糖波动也可以抑制ID1 活性，从而抑制FT4 向FT3的转化，导致FT3 降低。此外，DF 组的HbA1c与C 组相比并没有统计学差异，说明两组之间只有血糖波动的差异，因此我们可以认为即使控制了糖尿病小鼠的糖化血红蛋白水平，血糖水平的波动仍然可以导致ID1 活性的降低和FT3水平的降低。

总之，本研究结果揭示，糖尿病小鼠的高血糖可通过抑制肝脏脱碘酶的活性使FT3水平降低，同时，即使控制了糖化血红蛋白水平，血糖水平的波动仍然可以导致FT3水平的下降。