卵巢浆液性癌患者腹水中GRB7蛋白与BRCA基因表达的相关性分析

吴珊

[关键词] 浆液性癌;恶性腹水;GRB7;BRCA

[中图分类号] R737.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）16-0012-04

Correlation analysis between GRB7 protein and BRCA gene expression in ascites of patients with serous ovarian carcinoma

WU Shan

Department of Obstetrics and Gynecology， Xianning Maternal and Child Health Hospital in Hubei Province， Xianning 437000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between GRB7 protein expression and BRCA gene mutation in ascites tumor cells of patients with serous ovarian carcinoma and its clinical significance. Methods From July 2017 to June 2020， cancerous ascites in 31 patients with serous ovarian cancer were collected. The expression of GRB7 protein was detected by Immunohistochemistry（IHC）. The BRCA gene mutation status was detected by high-throughput next-generation sequencing （NGS）. The correlation between the two was analyzed based on clinical characteristics. Results The positive expression rate of GRB7 protein in the ascites of 31 patients with serous ovarian carcinoma was 51.6% （16/31）. The positive expression rate of GRB7 was correlated with distant metastasis of patients（P<0.05）， but it was not related to age， lymph node metastasis， surgery， andradiotherapy/chemical/targeted therapy（P>0.05）. The BRCA gene mutation rate was 22.6%（7/31）， including 5 cases of BRCA1 mutation and 2 cases of BRCA2 mutation.GRB7 correlated with the results of BRCA （r=0.79， P<0.05）. Conclusion Serous cancer ascites cell wax block is a reliable source of specimens for GRB7 protein and BRCA gene detection. GRB7 protein expression is correlated with BRCA gene mutation， and it is a potential treatment and prognostic target for serous ovarian cancer.

[Key words] Serous carcinoma; Malignant ascites; GRB7; BRCA

漿液性癌为卵巢最常见的上皮性恶性肿瘤，病死率占所有妇科恶性肿瘤的首位[1]。当晚期浆液性癌发生腹腔播散后往往失去手术机会，以铂类和紫杉醇为基础的化学治疗在此取得了一定的效果，但由于患者无法耐受和易短期复发等因素，严重影响临床应用前景，而具有选择性高、副作用少、作用精准的分子靶向药物为此提供了新的方向[2]。卵巢浆液性癌与BRCA基因的关系密切，其阳性表达被认为是促进肿瘤发生的重要因素，可以作为临床制定个性化治疗方案、预后评估和随访的重要依据[3]。2017版中国妇产科专家共识[4]推荐，所有的卵巢癌无论其年龄及有无家族史，均需要进行BRCA基因检测。而GRB7蛋白的过表达被认为与乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤的发生存在着重要的联系，正成为新的研究热点[5]。本研究以卵巢浆液性癌患者恶性腹腔积液（Malignant peritoneal effusion，MPE）细胞学为研究对象，探讨卵巢浆液性癌患者MPE中的GRB7蛋白表达与BRCA基因突变的相关性及其临床意义，为细胞学标本的临床分子学检测和卵巢浆液性癌MPE患者的个体化诊疗方案提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2017年7月至2020年6月经病理形态学及免疫组化确诊为卵巢浆液性癌的31例MPE患者，年龄34～72岁，中位年龄56岁，同时记录患者的淋巴结转移、远处转移、有无手术切除及放/化/靶向治疗等情况。

1.2 标本的制备

新鲜MPE倒入50 mL试管高速离心，尽可能多地收集肿瘤细胞沉渣，酒精固定后，常规取材、包埋制成细胞学蜡块。

1.3 免疫组化及抗体

GRB7为美国Agilent公司产品（工作浓度1∶100）。高年资技师常规石蜡4 μm切片，采用SP法按照GRB7试剂说明书规范操作，以磷酸盐缓冲液和正常卵巢组织为阴性对照，阳性切片为阳性对照。GRB7阳性为棕黄染色，定位于包膜和胞质。按肿瘤细胞表达的阳性占比和强度分别计数，其中（2+～3+）认为表达阳性，（0～1+）认为表达阴性。

1.4 NGS测序

QIAamp DNA FFPE DNA 抽提试剂盒（德国Qiagen公司）按操作说明提取MPE蜡块基因组DNA;使纯度A260/280和浓度分别保持在1.8～2.0 ng/μL和10～15 ng/μL之间;采用二代测序DNA建库试剂盒（Illumina平台）构建DNA测序文库，对目标DNA片段利用特定的探针进行样本的杂交捕获;Illumina Miseq 测序平台进行上机测序，测序读长和深度为150 bp和>500 X;所得的原始数据进行标准化数据分析并过滤，最后行生物信息学分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计数资料行χ2检验及Fisher精确概率法，相关性分析采用Logistic回归分析。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GRB7蛋白表达与临床特征的关系

31例卵巢浆液性癌MPE细胞学蜡块行石蜡切片和HE染色检测肿瘤细胞含量（封三图1）。免疫组化检测GRB7结果显示（2+～3+）阳性表达率为51.6%（16/31）（封三图2），在设立的正常对照卵巢组织中表达阴性或弱阳性。GRB7的阳性表达与肿瘤远处转移存在相关性[66.7%（14/21）;20.0%（2/10），P=0.023]，但与年龄（≥50岁）[42.9%（6/14）;58.8%（10/17），P=0.479]、淋巴结转移[58.3%（14/24）;28.6%（2/7），P=0.221]、手术切除[52.9%（9/17）;50.0%（7/14），P=0.578]及放化疗及靶向治疗[46.7%（7/15）;56.3%（9/16），P=0.431]无明显相关性。见表1。

2.2 BRCA基因突变情况

31例卵巢浆液性癌MPE标本中，其中7例检测到BRCA基因突变，总突变率为22.6%，包括无义突变5例和移码突变2例。其中BRCA1（封三图3）和BRCA2（封三图4）基因突变率为分别16.1%（5/31）和6.5%（2/31）。根据遗传变异分类指南（ACMGA）和生信分析软件预测危害结果显示，其中6例为致病性BRCA基因突变，1例为可能致病（病例5，BRCA1，c.2566T>C）。见表2。

2.3 GRB7蛋白表达及与BRCA基因的相关性

31例卵巢浆液性癌MPE标本中，GRB7蛋白表达及与BRCA基因突变率分别为51.6%（16/31）和22.6%（7/31）。两者均有阳性表达且一致的有6例，两者均为阴性表达的14例;不一致者11例，其中BRCA基因突变而GRB7蛋白表达阴性的仅1例病例。采用Spearman分析检验两者相关性发现，GRB7蛋白表达与BRCA基因突变水平呈正相关（r=0.79，P<0.05）。见表3。

3 讨论

MPE的成因较为复杂，据统计一半以上的晚期卵巢浆液性癌患者可合并发生[6]。研究认为MPE的发生与浆液性癌细胞恶性程度高、黏附性差，极易穿透卵巢包膜形成腹腔内广泛播散种植，同时易于侵犯脉管，阻塞淋巴管，使淋巴液回流受阻[7]。当发生MPE时，患者已经处于疾病的绝对晚期，往往失去手术机会，无法取得活检组织，失去基因检测的机会，而细胞学蜡块技术为此提供一个很好的机会，具有微创性、来源方便、可反复操作、易于保存等优点，为进一步基因检测和预后评估提供了便利[8]。GRB7蛋白作为一类生长因子受体结合蛋白，由535个氨基酸残基构成，共存在5个功能区，能通过SH2结构区识别磷酸化酪氨酸，激发肿瘤表面受体和特异性下游信号的耦联，调控下游信号转导通路[9]。已有研究表明GRB7的过表达能够独立或协同其他基因、蛋白参与肿瘤细胞的生长、浸润和迁徙，能提高ERK磷酸化和FOXM1的水平，激活高级别卵巢浆液性癌的发生，而降低GRB7活性能够显著地抑制肿瘤细胞迁移/侵袭、肿瘤生长[10]。BRCA1/2为卵巢浆液性癌的易感基因，BRCA1由1863个氨基酸残基构成，定位于17q21号染色体上，BRCA2由3418个氨基酸残基构成，定位于13q12号染色体上[11]。当BRCA基因发生突变后能够产生截短蛋白，诱导肿瘤细胞重组和修复缺陷，从而破坏基因组的稳定性，促进肿瘤增殖[12]。进一步研究发现BRCA基因突变，同样也增加了针对DNA双链断裂和DNA单链损伤修复的PARPi抑制剂对肿瘤的敏感性，针对性的用药能显著延长患者的生存周期，而未发生BRCA基因突变的晚期患者，由于无敏感性的靶点药物，预后依然极差[13]。因此，寻找潜在治疗和预后评估的靶点，正成为晚期卵巢浆液性癌研究的热点。

本研究显示，在31例卵巢浆液性癌MPE患者中，GRB7蛋白阳性表达率为51.6%（16/31）。在与临床特征的关系上，GRB7蛋白的表达与年龄、淋巴结转移、手术切除及放化疗及靶向治疗等因素无关，但与肿瘤的远处转移存在明显的相关性，Wang等[14]应用免疫组化法研究发现GRB7蛋白与卵巢癌进展存在显著的相关性，提示GRB7蛋白的高表达能够导致肿瘤的侵袭和迁移，GRB7有望成为评判肿瘤的恶性程度及预后的一个重要標准。31例卵巢浆液性癌MPE患者中共发现7例（22.6%）BRCA基因突变，其中BRCA1突变5例，BRCA2突变2例。突变模式均为无义突变和移码突变（包括插入突变和重复突变），未发现其他内含子突变。7例突变病例中6例（85.7%）为高致病性突变，1例为可能致病性突变。Eccles等[15]通过大样本回顾性研究发现卵巢癌中BRCA基因的综合突变率约为14.1%，其中的高致病BRCA突变约70%。本研究无论是突变率还是所含高致病性突变率均有升高，这可能与亚洲人群相对于欧美人群卵巢癌BRCA基因胚系细胞突变率更高[16]或本研究收集的病例为卵巢浆液性癌MPE样本恶性程度更高有关。

目前多量的研究证实，GRB7蛋白和Her2基因在乳腺癌中存在着强相关性，两者在肿瘤发生发展的进程中具有协同性，抑制肿瘤细胞中GRB7的高表达，可以提高Her2抑制剂的抑制效果[17]。而同样与乳腺癌密切相关的GRB7蛋白和BRCA基因的高表达各自在卵巢癌的发生发展中起到重要的作用。本研究通过分析卵巢浆液性癌MPE中GRB7蛋白表达及与BRCA基因两者相关性发现，两者的相关度r值为0.79，证实结果为正相关。提示两者在卵巢浆液性癌的发生发展中可能存在协同和促进作用，而通过有效的抑制GRB7的高表达，或许能提高针对于BRCA的PARPi抑制剂的效果。目前GRB7蛋白或基因的靶向治疗还处于实验阶段，但已有研究结果发现环肽结合磷酸化络氨酸能够通过抑制GRB7表达来使肿瘤细胞失去增殖活性，极有可能成为潜在的治疗热点。

综上所述，卵巢浆液性癌腹水脱落细胞是GRB7蛋白与BRCA基因检测的可靠标本来源，GRB7的高表达与肿瘤的远处转移密切相关，是作为评价卵巢浆液性癌预后的指标。GRB7蛋白的表达与BRCA基因突变存在着相关性，GRB7是卵巢浆液性癌的潜在治疗和预后评估的靶点。然而，由于本次纳入研究病例较少，且未进一步阐明GRB7与BRCA相互的分子机制及联系，有待于接下来进一步大样本的深入研究。

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（收稿日期：2021-01-04）