肠杆菌科细菌对氨基糖苷类的耐药性及16S rRNA甲基化酶基因的检测研究

王 文， 王 亮， 陶 佳， 李 刚， 贾 伟

当前革兰阴性杆菌的耐药性日趋严重，尤其是多重耐药和泛耐药菌株的出现已成为全球关注的焦点。氨基糖苷类抗菌药物因其抗菌谱广、抗菌活性强，被用于抗耐药革兰阴性菌感染的临床治疗，尤其是肠杆菌科细菌所致的感染，已经成为联合用药的重要选择之一[1]。但16S rRNA甲基化酶的出现和扩散，导致了细菌对氨基糖苷类抗菌药物高水平耐药，影响了其临床抗感染治疗。本研究对宁夏医科大学总医院2017年分离的氨基糖苷类耐药肠杆菌科细菌的16S rRNA甲基化酶基因进行筛查，并对耐药情况进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集我院2017年1月1日—12月31日临床诊断为各种包括呼吸道、腹腔、尿路、血流和皮肤软组织等感染分离的非重复肠杆菌科细菌142株，其中包含对阿米卡星耐药的肠杆菌科细菌72株（大肠埃希菌37株、肺炎克雷伯菌35株），对阿米卡星敏感的肠杆菌科细菌70株（大肠埃希菌32株、肺炎克雷伯菌38株），称为氨基糖苷类耐药/敏感肠杆菌科细菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853，购自上海汉尼生物技术有限公司。

1.2 仪器和试剂

采用法国生物梅里埃全自动细菌分析仪VITEK 2-Compact对细菌进行鉴定，仪器配套药敏卡GN04初筛阿米卡星耐药（MIC≥64 mg/L），肉汤微量稀释法进行药敏复核，按照2017年美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准判断结果。

1.3 基因扩增和测序

将142株细菌分纯培养后，用煮沸法提取细菌DNA[2]。取1 μL提取物做模板，对16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH、npmA） 进 行 PCR扩增，将阳性扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行测序，所得序列用BLAST软件（https:www.ncbi.nlm.nih.gov/）分别进行比对。引物见表1， 具体反应条件参见文献[2-7]。PCR 产物作1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后经溴化乙啶染液染色15 min，在紫外凝胶成像仪中观察并记录结果。

表1 16S rRNA甲基化酶基因引物序列Table 1 Primers of 16S rRNA methylase genes used in this study

1.4 统计

采用WHONET 5.6软件对细菌的标本来源、科室分布、药敏进行统计分析。

2 结果

2.1 病例和标本的分布

142株肠杆菌科细菌主要收集于临床明确诊断为呼吸道感染（31.7 %）、腹腔感染（23.9%）、尿路感染（23.3%）、血流感染（7.7%）等病例分离的菌株；大部分分离自痰液（31.0 %）、尿液（23.3%）、分泌物（11.3%）、血液（7.7%）等标本，见表2。142例患者中男79例，女63例；体温为36.0～40.0℃；WBC（2.22～54.86）×109/L；诊断为呼吸道感染的45例患者的X摄片显示肺部有炎性浸润性改变、肺部积液等。68 例大肠埃希菌感染患者多见于尿路和腹腔感染，74例肺炎克雷伯菌感染者多见于呼吸道感染，分布较大肠埃希菌集中。氨基糖苷类耐药株和敏感株所致感染分别占50.7%（72/142）和 49.3% （70/142），见表2。

表2 （续）Table 2（continued）

表2 142株肠杆菌科细菌感染患者相关的临床信息Table 2 Clinical data of the patients associated with 142 strains of Enterobacteriaceae

2.2 细菌的耐药性

72株氨基糖苷类耐药肠杆菌科细菌对阿米卡星和庆大霉素均耐药，对头孢菌素类、氟喹诺酮类的耐药率均大于80%，对酶抑制复合制剂头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦的耐药率在50%以上，对替加环素、头孢他啶-阿维巴坦的耐药率小于10%；其中37株大肠埃希菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南的耐药率分别为29.7%、32.4%、37.8%；35株肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南的耐药率均为40.0%。70株氨基糖苷类敏感的肠杆菌科细菌对阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、替加环素、头孢他啶-阿维巴坦、哌拉西林-他唑巴坦均敏感。见表3。

表3 142株肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药性和敏感性Table 3 Antimicrobial susceptibility of 142 strains of Enterobacteriaceae to antimicrobial agents

2.3 16S rRNA甲基化酶基因检测

经PCR检测和DNA测序，共检出71株16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株，占总菌数的50.0%（71/142），在氨基糖苷类耐药株中的阳性率 为 98.6%（71/72）。rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH、npmA均未检测到，基因分布见表2，扩增产物电泳图见图1。

图1 16S rRNA甲基化酶基因扩增产物电泳图Figure 1 Electrophoresis map for PCR products of 16S rRNA methylase genes

3 讨论

氨基糖苷类抗生素因其抗菌谱广、高效且浓度依赖性的快速杀菌特点，成为临床治疗革兰阴性杆菌感染有效的药物之一。但随着其广泛应用，耐药现象也随之而来。细菌对氨基糖苷类药物耐药的主要机制是产生氨基糖苷类修饰酶AME以及16S rRNA甲基化酶[8]，自2003年法国报道了产 16S rRNA甲基化酶的肺炎克雷伯菌后，多个国家均在革兰阴性杆菌中发现16S rRNA 甲基化酶[9-10]。

本组资料显示，对氨基糖苷类抗生素耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢菌素、氟喹诺酮类、氨曲南的耐药率均≥77.1%；对头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦等β内酰酶抑制剂复合制剂的耐药率≥51.4 %；还显示氨基糖苷类耐药的肺炎克雷伯菌对3种受试的碳青霉烯类药物的耐药率均为40.0%，但氨基糖苷类耐药的大肠埃希菌对碳青霉烯类药物的耐药率为29.7%～37.8%，与吴琼等[11]报道的均敏感不一致。由此可见氨基糖苷类耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌如同临床上发现的ESBL等菌株一样，亦是一类多重耐药菌株，或为广泛耐药菌株，需引起重视。所幸，替加环素及头孢他啶-阿维巴坦对这两种氨基糖苷类耐药的肠杆科细菌都有较好的抗菌活性，细菌的敏感率均≥94.3%。相比较氨基糖苷类耐药株，氨基糖苷类敏感肺炎克雷伯菌对多数受试抗菌药物均较为敏感，细菌耐药率均≤15.4%；但氨基糖苷类敏感大肠埃希菌对第三、第四代头孢菌素和氨曲南的耐药率≥25.8%，对氟喹诺酮类抗菌药物环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率为58.1%。因此在抗感染治疗时须依据药敏试验结果报告慎重选用抗菌药物。

本研究中， 仪器法检测到4株对阿米卡星耐药的大肠埃希菌，而庆大霉素对这4株菌株的MIC分别为8、8、≤1、≤1 mg/L，为一类庆大霉素中介/敏感菌株；经阿米卡星和庆大霉素肉汤稀释法复核后，结果显示此4株细菌均对阿米卡星和庆大霉素耐药，且都携带rmtB基因，证实仪器法检测结果为庆大霉素假敏感。先前Ko等[12]于2017年也有过类似报道，称VITEK-2 自动化系统对氨基糖苷类高水平耐药可能被错误地检测为敏感。此类不一致的药敏试验现象值得引起临床微生物实验室常规药敏检测的重视。

据文献报道，16S rRNA甲基化酶基因的分布因地域不同而有所差异。在欧洲以armA为主，在北美洲以armA和rmtB为主，拉丁美洲以rmtD为主[13]；在国内，如广州、长沙等南方地区以armA为主[14-15]；上海、江浙地区以rmtB为主[11,16]。本组资料显示，16S rRNA甲基化酶基因以rmtB为主，占76.1%（54/71），armA次之，为19.7%（14/71），与上海、江浙地区报道相似，基因分布的差异可能与菌株的来源及用药习惯的差异有关。本组资料中，发现1株rmtB和armA同时扩增阳性菌株以及2株rmtA阳性菌株，国内未见rmtA基因存在于肠杆菌科细菌中的报道。1株耐药大肠埃希菌所有基因扩增均阴性，推测可能存在其他未检测到的耐药机制。在70株氨基糖苷类敏感的肠杆菌科细菌中均未检测到16S rRNA甲基化酶基因，此与2010年余方友等[16]国内报道的研究结果一致。Joel等[17]2015年曾报道发现16S rRNA甲基化酶基因和碳青霉烯酶基因可存在于同一菌株中。本组资料亦显示有近40%的氨基糖苷类耐药的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对碳青霉烯类耐药，但本研究未对该类耐药细菌的碳青霉烯酶基因进行检测，有待进一步研究。

本组资料虽然没有过多的除阿米卡星和庆大霉素之外的其他氨基糖苷类抗菌药物的研究和相关传播机制等研究，但文献报道，16S rRNA甲基化酶与氨基糖苷类高浓度耐药存在相关性，且16S rRNA甲基化酶基因位于转座子、质粒等可移动基因元件中，能突破地域和种属界限，广泛进行水平传播和克隆传播[18]，因此应对16S rRNA甲基化酶基因进行早期筛查和监控，并采取措施防止耐药菌株传播。有待扩大样本量，继续调查本地区16S rRNA甲基化酶基因的流行情况，研究其耐药基因的传递机制，为控制医院感染和临床抗感染治疗提供科学依据。