治疗丙型肝炎药物的研究进展

陈铎之，郝小江

(中国科学院昆明植物研究所 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，云南 昆明 650201)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起急性与慢性肝脏疾病的主要病因.目前全球约有2亿人感染HCV，其中80%患者会最终发展成为慢性肝炎甚至肝硬化、肝癌[1-3].目前尚无疫苗预防HCV感染.长效聚乙二醇I型干扰素(PEGIFN-α)和利巴韦林(RBV)联合应用是近10年来治疗丙肝的最佳药物，但仍有50%以上I型HCV(GT 1HCV)感染者对该联合抗病毒治疗无效，同时有较为明显的毒副作用(如流感样症状、贫血以及抑郁症等)而且该疗法疗程较长，通常长达一年，因此限制了该疗法在临床上的应用[4-6].由于目前临床常用药有此类问题，因此近些年来，越来越多的研究人员将注意力集中在一些新机制抗HCV药物上，目前该类研究已取得了大量科研成果，甚至有一些治疗丙肝的新药已进入临床试验阶段.为了更好地研发治疗丙型肝炎药物，对自1995年以来治疗丙型肝炎药物的研究进展进行综述，并提出了一个比较有前景的研究方向.

1 干扰素

干扰素一直是治疗病毒感染的首选药物，慢性丙型肝炎临床症状较乙型肝炎轻，但同样可以进展到肝硬化，且有比较高的致癌几率，所以需要抗病毒治疗.而目前HCV肝炎抗病毒治疗最有效的药物为干扰素(IFN)[7-8].

1.1 普通干扰素

干扰素是一组细胞因子，是机体细胞在病毒感染或其他外源性刺激下生成的，其主要功能为分泌糖蛋白，干扰素具有广谱抗病毒活性，同时，在一些情况下，干扰素还同时可以调节免疫以及抗增生[9].干扰素不直接杀灭病毒，而是通过与细胞表面靶蛋白结合，经过信号通路传导后，抑制病毒蛋白的合成，从而抑制病毒的复制，在抑制病毒复制的同时，干扰素还可以调节免疫应答从而协同抑制病毒复制.尽管IFN目前最常用的抗病毒药物，但是其对HCV治疗效果并不理想，主要表现在持续病毒应答(SVR)率较低，仅为20%左右，但是也有学者认为，当丙氨酸转氨酶(ALT)持续正常超过6～12个月，且HCV RNA阴性，以此标准来看，IFN还是一类比较理想的抗HCV药物[10].但是IFN会造成比较严重的不良反应如流感样症状、贫血以及免疫系统疾病.

1.2 新型干扰素类药物

利用现代分子生物学和单克隆技术，一些新型的治疗效更好，安全性更高的干扰素得到了长足发展，其中最具代表性的便是复合干扰素和聚乙二醇干扰素.

1.2.1 复合干扰素(CIFN)

复合干扰素是用基因工程技术合成的28肽干扰素，是近年用于临床的一种新的干扰素制剂.它能更强地激活NK细胞的抗病毒和抗增殖活性，如干复津(infergen)主要用于治疗慢性丙型肝炎.它有9和 15 μg 2种剂型，9 μg CIFN相当于普通干扰素 3 MU.临床结果表明，皮下注射CIFN 9和 15 μg，每周3次，共24周，与IFN α-2a标准治疗比较， 9 μg 组与IFN α-2a组治疗终末应答(ETR)和持续病毒应答(SVR)无差异；15 μg 组ETR和 SVR均显著高于IFNα-2a组，提示复合干扰素可提高干扰素的疗效[11].

1.2.2 长效干扰素

1970年聚乙二醇(PEG)化技术的出现为优化治疗性蛋白质的分子特性提供了新方法，用大分子多聚体(PEG)对蛋白质进行修饰，通过酰胺键将聚乙二醇分子结合于干扰素分子上[11].聚乙二醇化的干扰素分子大幅度地延长了它在体内的半衰期，提高了生物利用度，增强了治疗效果，降低了毒性，减少了给药次数.美国FDA现已批准2种商品化的Pegylated IFNs.Lindsay[12]报道，HCV感染者接受IFN与聚乙二醇联合治疗，HCV清除率比提高4倍.由于其半衰期长，不会因每天给药引起抗药性、耐受性.

2 与干扰素联用的药物——利巴韦林(RBV)及其类似物

RBV对HCV几乎无直接抑制作用主要用作辅助药物与IFN联用以起到抗病毒的作用.当二者联用时，可显著增加患者抗HCV治疗的应答.国际推荐治疗方案为IFN-α 3-5 MU，每周3次，RBV 800～1 200 mg/d，为期6个月以上.RBV可能是通过作用于次黄嘌呤核苷单磷酸脱氢酶而抑制鸟嘌呤-5′-三磷酸(GTP)的合成，阻止病毒合成.同时还能增强T细胞辅助细胞-1(Th1)的作用，通过抑制T细胞辅助细胞-2(Th2)，从而调节免疫[13-15].

图1 利巴韦林及其类似物结构

RBV类似物viramidine是一种RBV的前药，它主要在肝脏中被丙氨酸脱氨酶迅速转化为RBV，所以它在肝脏中的需要浓度比RBV高3倍，其不良反应比RBV低.Levovirin是一种第2代RBV左旋对映体，它保留了免疫调节作用，能在体外增强Thl的细胞因子反应，在体内可以刺激机体产生广谱的抗病毒状态，并具有比RBV低得多的不良反应，在红细胞中几乎不见积累[16-19].

3 直接抗病毒药物(direct-acting antivirals，DAAs)

对HCV复制周期的研究使得一类治疗HCV新策略得到了发展，这就是直接作用于HCV组件的药物，被称之为“直接抗病毒药物”(DAAs)，这些药物已经被用作治疗新感染HCV或固有HCV感染的病人并且取得了令人鼓舞的结果.目前进行临床试验的治疗HCV的DAAs其靶点只要是HCV NS3蛋白酶，HCV NS5B RNA聚合酶以及NS5A蛋白[20].NS3蛋白酶抑制剂主要作用于丝氨酸蛋白酶同时抑制经过翻译的HCV多聚蛋白的水解从而阻止该蛋白进一步形成成熟的HCV.NS5B是由HCV编码的RNA聚合酶，其作用是催化正链RNA基因的形成[21].对该聚合酶的抑制会阻碍HCV基因复制.NS5A的功能目前并未完全研究清楚，不过可以肯定的是其在病毒复制过程中起到很重要的作用如调解NS5B聚合酶、细胞信号传导及病毒微粒释放等[22].

3.1 NS3蛋白酶抑制剂

3.1.1 BILN2061(Ciluprevir)

由加拿大Boehringer Ingelheim 公司研制的BILN 2061是世界上第一个进入临床研究的NS3蛋白酶抑制剂，该药物在临床前研究过程中发现，BILN 2061是一种非共价特异性GT1 HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂，同时该药物还可以很好的阻滞HCV多聚蛋白的形成，从而抑制HCV复制[23].当慢性肝炎患者口服ciluprevir 2 d，其血液中HCV RNA降低了2～4 log10(IU/mL)[24].这些令人满意的结果第一次在临床角度验证了DAA的有效性.尽管ciluprevir最终由于细胞毒性止步于一期临床研究，但是其临床研究结果促进了其他NS3/4A抑制剂的发展.特别要指出的是，科研人员通过对ciluprevir的基本骨架进行结构修饰已经发展出一系列的大环类NS3蛋白酶抑制剂如TMC-435等(表1).

表1 NS3/4a蛋白酶抑制剂活性情况

3.1.2 VX950(Telaprevir)

VX950是由Vertex Pharmaceuticals和Tibotec BVBA两家公司共同研制的另一类NS3/4A抑制剂，该药物通过与蛋白酶形成可逆的共价复合体从而抑制酶作用的发挥，其抑制指数(Ki)达到 7 nmol/L.需要指出的是，该药物对于GT2、GT3 HCV的抑制指数分别高出GT1型4～7倍与40倍，这就说明，VX-950是具有基因型选择性的[25].

在二期临床研究过程中，GT1感染病人单独服用VX950(每8h 750 mg) 15 d 后体内病毒减少1.3～5.3 log10IU/mL.在二期临床PROVE 1、2阶段中，在先进行为期12周的pIFNα/利巴韦林/VX950三元疗法后，再分别进行36周(PROVE 1)和12周(PROVE 2)的pIFNα/利巴韦林二元疗法，结果表明，在与VX950联用时pIFNα/利巴韦林的治疗时间可以显著缩短，该疗法带来的毒副作用因此也会显著降低[26].

PROVE 3阶段中，SOC无效的患者利用相同的治疗方法进行治疗，结果发现有38%～39%的患者产生了SVR，而单纯进行SOC疗法的患者中，这一数字仅为9%[27].这一结果表明，有VX950存在的三元疗法可以显著提高病人SVR产生率.

由于HCV的高复制率总是伴随着NS5B聚合酶的高变异性，因此在服用VX950 2周后便会出现抗药性，但是在与pIFNα/利巴韦林联用时，机体对VX950的抗药性会显著减少.与SOC相比，VX950没有明显的毒副作用，仅有个别患者会出现胃肠不适、贫血以及皮疹等症状[28].

所有的研究结果都表明，VX950是一个很有前景的抗HCV新药并且该药物已于2011年上市.

3.1.3 SCH503034(Boceprevir)

SCH503034 由Merck公司研制的一类NS3/4A蛋白酶抑制剂，在为期 14 d 的治疗过后，对SOC无效的患者体内HCV RNA水平降低了约 1.6 log10(IU/mL)，在与pIFN联用后病毒降低 2.9 log10(IU/mL).

基于这些结果，仙灵苞雅进行了2期临床试验，对GT1 HCV感染患者首先进行为期4周pIFNα/利巴韦林联合给药，接着是44或24周的pIFNα/利巴韦林/ SCH503034联合给药[29].令人喜出望外的是，研究结果表明三元疗法可以显著提高SVR形成比例(75%，44周；56%，24周).试验数据还表明，在发生RVR的患者中，产生SVR的患者比例在82%，这就说明将治疗周期从48周缩短到24周并不会显著降低治疗效果.

在临床试验过程中，个别患者会出现疲劳、贫血、恶心和头痛等不良反应.

3.1.4 TMC 435

TMC435是一种非共价大环NS3/4A蛋白酶抑制剂，是由比利时Tbotec公司和瑞典Medivir公司共同研制的，在二期临床研究中，新感染和过往感染患者进行了不同给药剂量(75、150或 200 mg)TMC435与pIFNα/利巴韦林联合给药，为期4周.三元疗法过后为44周的pIFNα/利巴韦林治疗，结果发现在 28 d 过后89%的患者发生了SVR而且其病毒浓度降低4.7～5.4 log10，观察到的副作用为恶心、腹泻以及头痛，但症状轻微[30].

3.1.5 RG7227(Danoprevir)

RG7227也是一种非共价大环NS3/4A蛋白酶抑制剂，一期临床表明，在单独服用RG7227 14 d 后，GT1 HCV感染患者体内病毒水平降低 3.9 log10，在联合服用pIFNα/利巴韦林后，病毒水平进一步降低了4.7～5.7 log10，在为期2周三元治疗过程中，13%～57%的患者体内基本上监测不到HCV RNA[31].在一期临床研究阶段，RG7227所造成的毒副作用都是温和且暂时的.

有趣的是，将RG7227与另一种NS5B聚合酶RG7128联用可以显著增加体外抗HCV活性，实验表明在RG7227/RG7128联用2周后便会出现明显持续抗病毒作用.而且该疗法副作用较小并无耐药反应[32].

3.1.6 其他NS3蛋白酶抑制剂

目前，有许多NS3蛋白酶抑制剂在研发过程中，其中有3个药物已进入2期临床阶段，这3个药物分别是：MK-7009 (vaniprevir)、SCH 900518 (Narlaprevir)和BI 201335.在2期临床研究中，MK-7009在与pIFNα/利巴韦林联用4周后患者体内RVR水平为69%～82%，再继续用药8周，患者EVR水平将提高到77～89%[33].当SCH 900518与pIFNα/利巴韦林联用 8 d 后，病人体内HCV降低4～5.5 log10，当病人连续服药4周后，其RVR与EVR分别提高至58～87%与84%～87%[34].当单独服用BI201335 14 d 后，患者体内HCV RNA降低3～4.2 log10，当继续联合用药 14 d 后该数字达到4.8～5.3 log10.

3.2 HCV NS5B RNA聚合酶(RdRp)抑制剂

HCV RNA聚合酶的三维晶体结构是经典的“拇指-手掌-食指”状结构[35]，在这个“手掌”中，“拇指”与“指尖”中间存在着大量相互作用力，形成了一个环状活性位点，在接下来对该酶与核苷酸共结晶研究表明，在“拇指”与“食指”相连的地方存在一个rGTP口袋.这个“口袋”起变构的作用[36].HCV RdRp对病毒的复制至关重要，而且无宿主等价酶，因此，该酶被作为抗病毒治疗的主要位点，至今为止，大多数抗病毒药物靶点均是病毒聚合酶[37].

目前HCV RdRp抑制剂从结构上主要可以分为2类：核苷类衍生物和非核苷类衍生物.核苷类衍生物主要通过竞争性与聚合酶活性位点结合起作用，该类化合物抗病毒谱往往较宽.而另一方面，非核苷类抑制剂起作用则更具特异性，通过与活性位点直接结合或阻止聚合酶引发而起效.

吉利德四代抗丙肝药物

HCV NS5B RNA聚合酶(RdRp)抑制剂的代表药物就是由吉利德公司研发的四代抗HCV药物.吉一代 (Sofosbuvir,索非布韦)2013年12月获批上市；吉二代(Harvoni，索非布韦与雷迪帕韦的复方药)2014年10月获批上市；吉三代(Epclusa，索非布韦与维帕他韦的复方药)2016年6月获批上市.吉四代(Vosevi，索非布韦、维帕他韦与伏西拉普瑞韦组成的复方药物)，该药物可以实现对丙型肝炎患者的完全治愈.

索非布韦是首个无需联合干扰素就能安全有效的治疗丙肝的药物，临床证实主要针对1和4型的丙肝.针对2型丙肝，该药物联合利巴韦林的持续病毒应答率(SVR)为89%～95%.针对3型丙肝，该药物联合利巴韦林的SVR为61%～63%.Harvoni主要用于1、4、6型丙型肝炎的治疗,是FDA批准的第一个用于治疗基因1型丙型肝炎的全口服复方制剂，无需联用注射干扰素，可单药使用，12周对慢性丙肝患者的治疗有效率达到95%～98%.Epclusa适用于全部6种基因型丙肝患者的治疗，效果更佳，治愈率更高，副作用更小.第四代Vosevi是一种含3种固定剂量成分的组合药片，也是首个获批的每日一次单片治疗的药物,适用患者群体为先前用含有NS5A抑制剂方案治疗失败的基因型1、2、3、4、5或6成年病人，以及先前使用含有索非布韦但无NS5A抑制剂方案失败的基因型1a或3成人，实现了对丙肝病人的全覆盖.得益于上述四代药物的开发，目前丙型肝炎可以说已被人类完全攻克.

3.2.1 核苷类抑制剂

核苷类抑制剂，不论是链阻滞剂还是非链阻滞剂，可以有效抑制病毒复制，当进入细胞后，核苷类似物首先转化成核苷三磷酸(NTP).这种非自然的核苷类抑制剂一方面作为聚合酶的竞争物质另一方面还可以整合进起始链中，这种整合使得RNA链的延长过早终止[38].同时，整合的核苷抑制剂会造成碱基错配，进而造成病毒的累积突变以至于所谓的“误差灾变”.但是，其他研究表明，在治疗HCV过程中，利巴韦林与干扰素联用可以帮助患者恢复免疫响应[39]，这就说明利巴韦林是一种多效性的药物，但是由于利巴韦林的作用机制目前还不明确，因此其也是美国食品药品管理局(FDA)批准的唯一一个核苷类抗HCV药物.

近些年，有关研究报道了几个糖醛类和碱基类核苷衍生物可以抑制RdRp酶活性进而阻滞HCV复制[40-41].在这些化合物中，最具应用前景的就是C-2、3-位取代核糖核酸类衍生物.默克实验室研究发现2-C-甲基胞苷(1)和2-O-甲基胞苷(2)在体外具有很好的抑制NS5B聚合物活性[42].通过研究其作用机制发现该化合物通过与RNA竞争性结合并且在整合至RNA中后作为终止子终止了链的复制.C-2位上甲基通过阻碍了通过空间位阻使得序列无法与核苷酸进行融合.2-C-甲基鸟苷(3)以及另外一些核苷类似物与2-C-甲基腺苷、2-甲基胞苷作用机理相似，此外，其他含有C-2甲基的腺苷类似物也具有很好的抗HCV活性.

2-去氧-2-氟-2-C-甲基胞苷(4)具有很好的抗HCV活性，其EC90=5.4 M，可以与2-去氧-2-氟胞嘧啶核苷相媲美.而且，该化合物细胞毒性很弱.有趣的是，该化合物对牛痢疾病毒(一种与HCV密切相关的病毒)无抑制作用[43].此外，有研究发现了一系列3-脱氧核苷衍生物，该类化合物可以作为终止子终止RNA链的延长.其中有一个典型化合物即3-脱氧胞苷(5)具有非常好的HCV抑制活性[44].

NM283(6)，是一类很有前途的口服高生物利用度药物2-C-甲基胞苷(NM107)的前药.NM283通过2条途径对病毒编码的RNA聚合酶起作用：直接作用于聚合酶以及整合进入延长中的病毒RNA从而终止其复制.NM283是第1个进入2期临床的抗HCV药物.通过为期四周的口服药物治疗表明：NM283与pIFNα/利巴韦林联用表现出良好的治疗效果同时期药物耐受度也较理想[45].

图2 核苷类抑制剂结构图

最近，Roche公开了一项研究成果，在一项多剂量递增实验中，R1626(一个新结构HCV聚合酶抑制剂)，表现出了优异的抗HVC活性，该化合物是R1479的前药，通过临床研究发现，R1626在体内能够高效转化成R1479.在服用R1626 14 d，每天 1 500 mg 后，病人血液中HCV RNA降低了 1.2 log10[46].

3.2.2 非核苷类抑制剂

与活性位点不同，通过对NS5B与化合物共晶的X线衍射分析，发现了在与之前发现的活性位点相距较远的地方，有一个构象调节位点，该位点也成为发展新型抗病毒药物的靶点之一[47].因此，当化合物与RdRp活性位点或者构想调节位点相互作用可以影响底物与酶的结合或者其构象的转化，这些化合物因此也可以高效抑制HCV.目前，有结构不同的几类非核苷类抑制剂已经被发现.

近日，一类α，γ-二酮酸类化合物被证明可以作为HCV抑制剂[48].对该类化合物进行构效关系研究后发现，该类化合物中的二酮酸对于抗HCV活性至关重要，同时，将γ-位的芳基替换为噻吩基以后，化合物的疗效和选择性都有了显著提高[49].对该化合物进行更进一步的优化以后得到了一个活性优良的HCV NS5b RNA 聚合酶抑制剂，其EC50为 45 nmol/L.

有研究认为认为二羟基嘧啶类衍生物可以像二酮酸类化合物一样与酶活性位点内两分子催化性镁离子结合[50].但是目前并没有该类化合物的体内试验数据.

苯并噻二嗪及其衍生物也是一类具有良好抗HCV活性的化合物，其中一个化合物其抑制NS5B聚合酶EC50为 80 nmol/L，对HCV其EC50为 500 nmol/L[51]，此外，该类衍生物还表现出对HCV RdRp的高选择性，不会对其余病毒以及聚合酶起抑制作用.当与干扰素联用时，该类化合物可以表现出很强的协同作用[52].进一步研究发现，该类化合物并不是通过与NTP竞争性整合到RNA从而阻止RNA复制而起作用，而是通过与HCV NS5B聚合酶活性位点结合起效.当分子中的喹啉酮结构被吡咯酮取代以后，会使得化合物抗HCV活性显著提高[53].

苯并咪唑类衍生物是第1类非核苷HCV NS5B RNA聚合酶，其中一个化合物其对HCV NS5B RNA聚合酶EC50达到亚微摩尔级在对该化合物作用机理进行研究后发现，该化合物并不与NTP竞争整合至RNA，而是通过抑制异构酶活性从而起到抑制RNA聚合酶的活性[54].对苯并咪唑与苯并噻二嗪的交互抗性和协同作用研究研究发现这两类结构迥异的化合物无交叉位点，因此说明以上两类化合物其作用机理不同[55].Boehringer Ingelheim公司通过拓扑扩大的方法合成了一系列含苯并二唑的杂环化合物[56].有趣的是，后来通过将苯并咪唑取代为吡唑-嘧啶结构而得到的衍生物具有良好的抗HCV NS5B聚合酶活性[57].研究人员之后又发现了两类HCV RNA聚合酶抑制剂.苯基丙氨酸和噻吩羧化物.经过研究，其中的典型化合物是通过与一个异构化位点结合从而抑制HCV NS5B RNA聚合酶的活性[58-59].

除此以外，还有一些前景光明的非核苷抑制剂正在进行临床研究.

R803是一个小分子 HCV RdRp抑制剂，其EC50=10 nmol/L，R803目前正在进行多剂量1、2期临床试验，但是由于发生了比较严重的毒副反应，该药物的临床试验目前已终止.HCV-086是另一个口服小分子HCV NS5B RNA聚合酶抑制剂，一期临床研究表明，该药物效果良好，安全系较高，但是，该药物总体药效难以保证，因此已停止研发.HCV-796是一种新型非核苷类聚合酶抑制剂，目前正在进行与干扰素联用的临床试验，通过双盲、安慰剂对照以及递增剂量试验表明，该药物药效良好且不会造成严重的毒副反应[60].

4 作用于宿主细胞的药物及候选先导化合物

除以上机制外，另一类比较有前景的治疗丙肝的策略是将宿主细胞作为治疗靶点，宿主细胞是HCV复制不可或缺的条件，因此对宿主细胞中某些因素进行调控可以影响HCV的复制.目前主要从抑制病毒进入细胞、核糖体内部进入位点抑制剂、抑制病毒RNA复制以及阻滞病毒装配和释放4个方面来进行研究.

4.1 热激同源蛋白70(Hsc70)抑制剂

有越来越多的证据表明：宿主蛋白是病毒粒子的组成部分之一，这些蛋白会帮助病毒躲避人体免疫系统的识别或者帮助病毒更好的进入细胞释放.蛋白组学研究结果表明Hsc70是高纯度HCV J6/JFH病毒粒子的重要组成部分.将HCV病毒颗粒与Hsc70抗体联合培养会降低病毒感染性.

2010年蒋建东课题组首先发现了一个可以下调宿主Hsc70表达的苦参碱类衍生物——IMB-DM122(图3)，通过对其抗HCV活性进行测定发现，该化合物可以安全有效的抑制HCV的复制，在研究中发现，IMB-DM122通过作用于Hsc70 mRNA 3′非编码区，从而阻碍mRNA复制，同时在药物作用下HCV mRNA半衰期缩短达78%.在研究中他们还发现，抑制Hsc70表达可以阻止病毒衣壳组装从而达到抑制病毒复制的作用[61].

图3 苦参碱类衍生物结构图

最近，研究中发现，石蒜西定(lycoricidine)也是一类通过抑制Hsc70表达从而抑制HCV复制的生物碱，其EC50=0.52 nmol/L，在此基础上，我们设计合成了20个石蒜西定衍生物并对其构效关系进行了研究，结果发现，石蒜西定C-1与10b-位的双键以及C-2、C-3、C-4、5-位的烷基化对化合物活性有显著影响[62](见表2).

表2 石蒜西定衍生物构效关系

综上所述，对Hsc70抑制剂抗HCV活性的研究，在治疗HCV的新疗法以及广谱抗病毒药物研究方面有着广阔的应用前景.

4.2 亲环蛋白抑制剂

4.2.1 进行临床实验的亲环蛋白抑制剂

目前，有一类很有发展前景的亲环蛋白抑制剂被开发出来，特别要指出的是有3个候选化合物：Alisporivir(Novartis), NIM-811 (Novartis)以及 SCY-635(Scynexis)已进入临床试验阶段，从1、2期临床试验数据可以看出，这3个化合物有着理想的安全性以及治疗效果(表3).

表3 亲环蛋白抑制剂活性总结

续表3

1) Alisporivir Alisporivir是一类通过合成得到的cyclosporineA(CsA)衍生物，它也是第一个投入临床试验的口服非免疫抑制型亲环蛋白抑制剂在体外试验中，该药物表现出了有优异的抗HCV活性，这种活性的表达与抑制亲环蛋白具有非常密切的关系.

(a) Ⅰ期临床研究 该药物Ⅰ期临床试验历时 15 d，采取双盲、安慰剂对照的方式进行.每日口服2次，每次口服剂量 1 200 mg.该药物经口服后可以被迅速吸收，2 h 后血药浓度达到峰值，其半衰期长达 100 h.在服用alisporivir的受试个体中，HCV-RNA降至3.6 log10水平，在16名服用药物的个体中，有15人HCV病毒载量降了 2 log10以上.其中更有3名病人在治疗开始8～15 d 后体内病毒几乎难以被检测到.在该研究中，所有3种HCV基因型(GT1、GT2以及GT4)对归一化药量响应良好同是没有一例参试样本出现病毒学反弹现象.通过这些实验可以表明，alisporivir具有泛基因型抗病毒能力及低耐药性.但是，该药物引起的暂时性高胆素血症使得在一些病人身上进行的试验不得不中止[63-65].

(b) Ⅱ期临床研究 在该药物Ⅱ期临床阶段，主要考察了该药物与pIFNα连用对慢性丙型肝炎患者的治疗效果[66-71].90例参试对象分别按以下4种给药方案之一进行了为期 29 d 的治疗：(a)pIFNα + 安慰剂；(b)pIFNα + alisporivir(200 mg/d)；(c)pIFNα+alisporivir(600 mg/d)；(d)pIFNα+alisporivir(1 000 mg/d)以及(e). alisporivir(1 000 mg/d).在感染了GT1和GT4基因型HCV的乙肝患者中，在治疗 29 d 后，其体内HCV RNA降低值如表4所示.

表4 Alisporivir临床数据统计

在利用d给药方案的12位患者中，有8位在经过了 29 d 的治疗后，在其体内几乎检测不到HCV病毒，治愈率达到67%，而使用方案a和方案e的患者中，这一数字显著降低到了仅25%.在对感染GT2和GT3型HCV的6位患者单独使用alisporivir治疗(方案e)时，有4位患者体内几乎检测不到HCV病毒，治愈率达到67%，改组病人HCV RNA下降了4.22 log10.在较低剂量时，alisporivir的安全性与安慰剂相当.在口服 1 000 mg 药物的24名患者中，仅有5人表现出可逆高胆素血症症状.Alisporivir与pIFNα连用对感染GT1 HCV的患者的疗效也经过了考察：病人分别进行alisporivir/pIFNα/利巴韦林或安慰剂/pIFNa/利巴韦林治疗，时间为24周或48周，其SVR应答水平分别为76%和55%.于此同时，病人对alisporivir有良好的耐受性与极低的病毒学反弹几率[72-73].在服用alisporivir的患者中，70%的患者在停止给药或降低药量后出现了病毒学反弹现象.在口服alisporivir进行为期24周的应答指导治疗的患者中，3%的患者表现出强烈的高胆素血症.另有7%的接受48周治疗的患者有相同的副作用症状.但是这些副作用均可逆且未伴随转氨酶升高.上述结果表明，alisporivir 与pIFNα/利巴韦林联用在治疗GT1型HCV感染方面有显著地优越性.

在Ⅱ期临床试验中，alisporivir还测试其对感染GT2、GT3 HCV患者的治疗效果.数据显示，每天1次联合口服alisporivir 和利巴韦林对几乎一半的GT2、GT3 HCV患者有治疗作用.32%的患者在停药6周后机体依旧有清楚病毒的能力.除此以外，97%的被治疗患者在继续服用alisporivir 和利巴韦林后，在停药后的12周时间里，机体依旧具有清除病毒的能力[74].以上结果表明，alisporivir为今后治疗HCV感染提供了1个颇具潜力的选项.

2) NIM811 (Novartis) NIM811是第1个通过合成得到的Cyp抑制剂，它同样也是一类CsA衍生物，对该药物的研究发现，该药物免疫抑制活性非常微弱.同时，和Alisporivir一样，NIM811同样表现出了很明确的体外抗HCV活性.

(a) Ⅰ期临床研究 在Ⅰ期临床试验中，NIM811利用递增计量的随机双盲安慰剂对照的方式对GT1型HCV感染者进行 14 d 治疗，病人每日或每2日单独口服NIM811 10～600 mg.在所有剂量下，病人对NIM811均表现出良好适应性，病人转氨酶水平正常，未见病毒作用迹象[75].

(b)Ⅱ期临床研究 在Ⅱ期临床研究中，GT1感染者口服NIM811(600 mg)或者安慰剂 14 d，在治疗期的第 1 d 或第 8 d 联合服用pIFNα.结果表明，在联合用药的患者体内，其HCV RNA降低了 2.85 log10，而单独口服pIFNα的患者相同指标仅为 0.56 log10，同时，该药物未发现显著地副作用.

3) SCY-635 (SCYNEXIS) SCY-635是最新的非免疫抑制型Cyp抑制剂之一，该药物同样是CsA衍生物之一，也同样具有显著地体外抗HCV活性.

(a) Ⅰ期临床研究 在Ⅰ期临床研究中，对GT1 HCV感染病人进行了为期 15 d，随机、双盲、安慰剂对照、多计量给药.参试者被分为3组，分别递增给药至总量300、600、900 mg.在每组内，病人以6∶1的比例随机口服SCY-635或安慰剂，在治疗期间进行药代动力学评估和病毒监测.服用安慰剂以及低剂量SCY-635(300或 600 mg/d)的患者其病毒复制并无明显变化.而在口服 900 mg/d 的病人中，其体内病毒有明显的减少，其中最高降低了 2.2 log10，甚至有一名患者在口服药物 15 d 后体内几乎监测不到病毒.在1期临床过程中，并未发现病人出现明显的毒副作用[76].

4.2.2 研发中的Cyp抑制剂

1) Sangamides (BIOTICA) Sanglifehrin A，是一类与CsA结构不同的天然聚酮类化合物，在自然界中，该化合物及其衍生物是土壤细菌Streptomycessp. A92-308110次级代谢产物，因此，该化合物的工业化制备也是通过生物发酵方法.Sanglifehrins A～D 具有比CsA更强的抑制CypA异构化的能力[77].Sangamides是sanglifehrin A的氨基化衍生物，其具有优异的体外跨基因型抗病毒能力，该化合物可以有效清除肝癌细胞中的HCV病毒，并且在和一些直接作用药物联用的时候有明显的协同作用.初步的药代动力学研究表明Sangamides适合日常口服给药.与CsA所不同的是，Sangamides不会显著抑制MDR1——一类可以加强药物配伍作用的蛋白.同时，Sangamides还被证明对MRP2没有明显的抑制作用[78].

2) EP-CyP546 (ENANTA) EP-CyP546是一类非免疫抑制Cyp抑制剂，体外实验表明，该化合物抗HCV活性为EC50=100 nmol/L(GT1b)及 121 nmol/L(GT1a).同时，有趣的是，EP-CyP546在40%人血清存在条件下依然持续保持有效，这与其他Cyp抑制剂有明显不同.此外，该化合物与pIFNα以及DAAs联用是有明显的协同作用，且相互间无不良反应.EP-CyP546与一类NS5A抑制剂联用时，可以显著降低常见的药物耐受作用[79].目前并无对该类化合物成功合成的报道.

3) F680 与F684 这2种化合物是通过基于片段药物分子设计方法(FBDD)设计的小分子(100～150Da)，这2个化合物有明显的抑制CypA、CypB和CypD的活性.更为重要的是，两者在显示出良好活性(F680∶IC50=3.12 μmol/L；F684∶IC50=0.87 μmol/L)的同时并未表现出明显的细胞毒性[80].

4.2.3 亲环蛋白

2003年Watashi等首先发现亲环蛋白抑制剂——CsA和NM811可以在体外抑制HCV复制，该发现首次揭示了Cyp与HCV之间的关系[81].这项里程碑式的发现又陆续被其他几个研究小组所证实[82-87].通过暂时下调CypA、CypB、CypC、CypH、Cyp40以及CypE可以抑制HCV复制，从而表明Cyps在HCV复制方面起着重要作用.而最新的研究表明，3个独立研究组的研究结果表明，在Cyp家族中，相比CypB与CypC，CypA对于HCV的复制至关重要[88-90].CypA 最初是从牛胸腺细胞中提取出来的广泛存在于真核细胞细胞质中[91].Fischer以及他的同事们发现，作为肽基脯氨酸顺反异构酶(PPIase)的一部分，CpyA的作用是催化脯氨酸残基的反转[92-94].CsA可以与CpyA疏水空腔结合从而抑制其异构酶活性[95-96]，从而说明CpyA是Cpys抑制剂的主要体内靶点.

4.2.4 亲环蛋白抑制剂的作用机制

有研究表明，HCV NS5A蛋白是CypA的直接配体[97-104].该发现也恰好与在Cyp抑制剂饲喂下HCV基因突变位点往往是NS5A基因的现象吻合.而最为关键的是，Cyp抑制剂阻止和破坏CypA-NS5A聚合体的形成[105]，在不同基因型HCV病毒中，CypA和病毒NS5A蛋白间的相互关系式保守存在的[106].这就可以完美解释为什么Cyp抑制剂不论在体内还是体外均可以抑制不同基因型HCV的现象.这也就是说，阻止CypA与NS5A的结合可以有效抑制HCV复制.通过晶体学研究手段可以表明：CypA可以直接与NS5A蛋白中的domains Ⅱ、Ⅲ区域结合[107]，由于该区域分布大量脯氨酸残基，正好与CpyA是作为PPIase一部分的事实相吻合.有趣的是，已经有研究表明NS5A蛋白domain Ⅱ区中含有一个NS5B RNA聚合酶结合位点[108]，如果CypA和NS5B都可与与这个位点结合，那就引出了一种可能性即：CypA可以作用于NS5A、NS5B或者同时作用于两者.假如以上假设成立，则会发生以下2种情况：一方面，NS5A作为一种内源性NS5B负调节蛋白，当其与NS5B结合后，会阻碍NS5B聚合酶活性的发挥，换言之，当Cyp与NS5A结合从而抑制其与NS5B结合时，NS5B可以自由的发挥其病毒RNA聚合作用使得HCV病毒得以复制(图4，Model Ⅰ)，当Cpys抑制剂与CpyA结合而使得其无法与NS5A结合进而令NS5A与NS5B结合从而阻止了HCV RNA的复制；另一方面，NS5A作为NS5B的正调节蛋白(图4，Model Ⅱ)，CypA通过与NS5A结合以促进其对NS5B的正调节作用.而Cyps抑制剂的加入使CypA-NS5A复合物被破坏从而破坏了NS5A对NS5B的激活作用，进而破坏了HCV的复制.

值得注意的是，最新的研究成果表明，Cyp抑制剂SCY-635在体内具有调节干扰素响应的活性，当每天口服SCY-635时，患者体内IFNα血药浓度会迅速提高(2 h 之内)，反观服用安慰剂和服用SCY-635的非HCV感染者体内干扰素水平并未显著变化.这些数据表明，在体内，对于CpyA的抑制可以既阻碍病毒复制又增加机体自身符合干扰素的表达.之前有研究表明NS5A可以抑制干扰素的表达.因此可以推测Cyp抑制剂通过破坏CypA-NS5A复合物的形成从而起到2方面作用：①干扰HCV复制；②激活自身干扰素表达.

图4 Cyps抑制剂作用机理

5 总结与展望

随着人们对于丙型肝炎的逐渐重视，对于治疗丙型肝炎药物的研发也吸引着越来越多科研工作者的目光，并且取得了一定进展，随着越来越多的抗HCV药物的上市，医疗人员在治疗该类疾病是也有了越来越多治疗手段和治疗策略.但是，不可否认的是，由于HCV本身所具有的的高变异性特点以及药物本身的安全性问题，因此，要开发出来一类在各方面都令人满意的抗丙肝新药，还有很多问题亟待科研工作者去解决.鉴于通过传统机制起效的药物由于机制本身条件限制都会有不同程度的问题，因此，对一些新机制，尤其是针对宿主方面机制的新型药物的研发或许是一个比较有前景的研究方向.