响应面分析法优化酶法提取小米谷糠蛋白工艺

曹阔 吴兴雨 孙凯杨 姚玥 马佳 孙丰梅

摘要：采用酶法提取小米谷糠蛋白，对小米谷糠进行脱胶、脱脂处理，以提取率为考察指标，从5种蛋白酶中筛选最适酶制剂。采用单因素试验和响应面试验优化酶的添加量、作用时间、作用温度、浸提pH值，得出对谷糠蛋白提取率的影响。结果表明，小米谷糠蛋白的最佳提取率对应的工艺条件如下：添加0.7%碱性蛋白酶，调节pH值为9，于50 ℃提取1.8 h，提取率为72.29%。由此可见，用碱性蛋白酶提取谷糠蛋白是一种高效的方法。

关键词：小米谷糠蛋白;蛋白酶;提取率;响应面分析法;酶制剂;单因素试验

中图分类号： TS210.4  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）18-0169-05

收稿日期：2020-11-12

基金项目：河北省科技厅项目（编号：18227132D）;河北省教育廳项目（编号：ZD2017205）。

作者简介：曹 阔（1994—），男，硕士研究生，研究方向为粮食副产物的加工与利用。E-mail：879077255@qq.com。

通信作者：孙丰梅，博士，副教授，研究方向为食品副产物加工利用与食品安全检测。E-mail：shiliu0616@163.com。

谷子（Setaria italica）属禾本科植物，别称稷、粟、粱，为一年生草本，目前多种植于欧亚陆地的温带和热带地区，我国的黄河中上游是其主要种植区。谷子在我国的种植历史可以追溯到六七千年前，是我国重要的粮食作物[1-2]。谷子加工成小米的过程中产生的副产物称为小米谷糠，小米谷糠富含多种维生素和微量元素，具有益气健脾、养血安神、补肾健脑的功效，对亏气血、脾肾功能弱的失眠患者能够起到积极作用。常食用谷糠能够提高人体免疫力，小米谷糠不仅可以健身防病，还能治疗失眠，是一种理想的补品[3]。在我国，人们更习惯将小米谷糠添加至饲料中。谷子在我国的种植面积广、产量大，所以产生的小米谷糠也非常多，而小米谷糠中的谷糠蛋白含量丰富[4]。此外，小米谷糠蛋白还有保健及抗癌的作用。许洁研究发现，小米谷糠清蛋白能对肝功能起到一定的保护作用，且氨基酸含量比大豆蛋白高，有益于婴儿生长[3]。单树花通过对小米谷糠蛋白进行分离纯化，得到了活性蛋白FMB，并证明其对肿瘤细胞的抑制作用，表明其具有开发利用的潜力[5-6]。

用酶法提取蛋白质的报道日渐增多，酶法具有条件温和、操作简单、得率高等优点，能够更好地保留蛋白质的功能性质。目前，常用的酶类有纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶等[7-9]。本试验通过粉碎、脱脂和超声等方式对小米谷糠进行前处理，利用Design-Expert 8.0软件对数据进行响应面分析[10]，进而得出最优的提取条件组合，以期为小米谷糠在饲料工业中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米谷糠，购自河北巡天农业科技有限公司;酶活性为50 U/mg的酸性蛋白酶;酶活性为100 U/mg的中性蛋白酶;酶活性为200 U/mg的碱性蛋白酶;酶活性为120 U/mg的复合蛋白酶;酶活性为 500 U/mg 的木瓜蛋白酶;牛血清蛋白标准品;考马斯亮蓝G-250、石油醚、无水乙醇、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

79-1磁力加热搅拌器，购自常州澳华仪器有限公司;JA-1003N电子分析天平，购自上海精密科学仪器有限公司;HH-S数显恒温水浴锅，购自江苏省金坛市医疗仪器厂;JYL-C50T九阳料理机，购自九阳股份有限公司;PHS-3C酸度计，购自上海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺 对小米谷糠进行脱脂处理后，粉碎过筛，加入10倍体积的蒸馏水，于超声中处理 30 min，加入酶，调节pH值后浸提，于100 ℃灭活酶，离心后收集上清液，测定清蛋白含量;收集离心后的沉淀物并加入0.1 mol/L NaCl，测定球蛋白含量;收集并测定球蛋白沉淀物，加入75%乙醇，测定醇溶性蛋白含量;收集并测定醇溶性蛋白沉淀物，调节pH值为11，用NaCl溶液溶解，测定谷蛋白含量，4种蛋白含量之和即为谷糠蛋白提取率[11]。

1.3.2 小米谷糠蛋白质含量及提取率的测定 小米谷糠中的蛋白质含量采用凯氏定氮法测定[12]，提取液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[13]。提取率的计算公式如下：

提取率=上清液中蛋白质含量原料中蛋白质含量×100%。

1.3.3 最佳酶的筛选 在各种蛋白酶的最适条件下提取小米谷糠蛋白（表1），筛选试验用酶制剂[14]。

1.3.4 单因素试验 分别测定加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）、提取温度（40、45、50、55、60 ℃）4个因素对小米谷糠蛋白提取率的影响。

1.3.5 响应面试验设计 采用响应面软件进行试验设计，以A（加酶量）、B（温度）、C（pH值）、D（时间）为4个因素，根据单因素试验的结果选取3个水平进行试验设计，试验设计方案见表2[15]。

2 结果与分析

2.1 考马斯亮蓝曲线的绘制

以牛血清蛋白为标准品，进行考马斯亮蓝曲线的绘制，结果见图1。

2.2 酶的筛选结果分析

由图2可知，按提取率由高到低排序为碱性蛋白酶>复合蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>酸性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的提取率达70.9%，因此本试验选择碱性蛋白酶作为酶制剂。

2.3 单因素试验结果分析

由图3可知，随着加酶量的增加，谷糠蛋白的提取率表现出先上升后趋于平缓的趋势，当加酶量为0.6%时，谷糠蛋白的提取率较高，当加酶量大于0.6%时，谷糠蛋白的提取率无明显变化。考虑到经济因素，选择最适加酶量为0.6%。

由图4可知，随着提取时间的延长，谷糠蛋白的提取率逐渐上升，当提取时间大于1.5 h，提取率趋于平缓，因此选择最适提取时间为1.5 h。

由图5可知，pH值是影响酶活性的重要因素，适宜的pH值将促进酶与蛋白质的结合，使提取率升高，谷糠蛋白的提取率随着pH值的升高而出现先上升后下降的趋势，当pH值为9.0时，谷糠蛋白的提取率最高。

由图6可知，谷糠蛋白的提取率随着提取温度的升高出现先上升后下降的趋势，当提取温度不断增加时，蛋白质分子获得更多的热能，加速了蛋白质间的碰撞，使得提取率上升;当提取温度大于 50 ℃ 时，会导致酶失活，因此提取率出现下降趋势。

2.4 响应面试验结果分析

响应面设计试验结果见表3，其方差分析见表4。由表4可知，回归模型具有极显著性（P<0.000 1），其失拟性为0.286 9，结果表现为不显著，可见该模型建立合理，能够更好地预测试验结果。影响提取率的因素排序为加酶量>提取时间>pH值>提取温度。通过响应面软件对米糠蛋白的提取率进行二次多项回归拟合分析，得到关于谷糠蛋白提取率的方程：Y=71.38+3.91A+2.82B+0.18C+0.13D-0.37AB+0.18AC-0.23AD+0.73BC-0.18BD+0.11CD-5.45A2-3.79B2-5.21C2-3.15D2。

用Box-Behnken软件对试验结果进行分析，得到响应曲面图和等高线图。从碱性蛋白酶的4个提取因素（加酶量、提取时间、提取pH值、提取温度）对小米谷糠蛋白提取率影响的等高线和响应曲面可以看出，三维响应曲面越陡，说明该条件对提取率的影响越明显，二维等高线越扁平，说明该条件的交互作用越明显。由图7至图9可以看出，4种条件对小米谷糠蛋白提取率的影响大小为加酶量>提取时间>pH值>提取温度。

3 讨论

根据响应面试验设计得到如下米糠蛋白提取率的最佳工艺条件：碱性蛋白酶用量为0.67%，提取时间为1.68 h，提取温度为49.99 ℃，pH值为9.02，相应的理论提取率为72.57%。考虑到实际操作，对最佳工艺条件进行修正后的加酶量为0.7%，提取时间为1.7 h，提取温度为50 ℃，pH值为9.0，根据该条件进行3次平行试验并取平均值，得到谷糠蛋白提取率为72.29%，与理论提取率72.57%间的误差小于1，说明该试验结果有效。

4 结论

本试验结果表明，碱性蛋白酶是提取小米谷糠蛋白的最优蛋白酶。采用超声波辅助酶法提取小米谷糠中的蛋白质，并采用响应面设计法，利用Design-Expert软件研究加酶量、提取时间、提取pH值和提取温度对提取率的影响。经试验得到最优提取条件组合为加酶量为0.7%，提取时间为 1.7 h，提取温度为50 ℃，pH值为9.0，实际提取率为72.29%。

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